タバコ製品調製物に曝露された末梢血単核細胞によるK562細胞の死滅

要約

出典: Arimilli, S. et al., Methods to Evaluate Cytotoxicity and Immunosuppression of Combustible Tobacco Product Preparations. J. Vis. Exp.(2015年)

このビデオでは、可燃性タバコ製品製剤である全煙調整培地が、エフェクター末梢血単核細胞によるK562細胞の死滅に及ぼす影響を研究しています。

プロトコル

1. K562 キリングアッセイ

>注:K562細胞は、アッセイ前に80%のコンフルエンスに達するまで、RPMI完全培地を用いて37°Cおよび5%_CO2の培養で増殖させる必要があります。

1. バイアルに18 μlのDMSOを添加して、5 mMカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル(CFSE)ストック溶液を調製します。
2. RPMI 完全培地を使用して 96 ウェルプレートで WS-CM またはニコチンを総容量 100 μl/well に希釈し、各ウェルの所望の等ニコチン単位またはニコチン濃度を達成します。
   注意： ニコチンは急性毒性があり、環境に有害です。
3. 100 μlのPBMCをRPMI完全培地に1.5 x^{10 6}細胞/ウェルの濃度で添加します。WS-CMまたはニコチンを含む細胞の総容量は200μl/ウェルになります。
4. プレートを覆い、37°Cおよび5%CO₂で3時間インキュベー
トします。
5. 10 mLのDPBSを加えてK562細胞を洗浄し、400 x gでRTで8分間遠心分離します。
6. 細胞を10 mLのDPBSで再懸濁し、K562細胞をカウントします。
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7. mLのDPBSに1 μlのCFSEストック溶液を加えて、CFSEワーキング溶液を調製します。
8. 1 mLのCFSEワーキング溶液を、1 - 2 x 10⁷個の細胞を含むK562細胞懸濁液1 mLに加えます。ボルテックスし、RTで正確に2分間インキュベートします。
9. すぐに200μlのFBSを加えます。ボルテックスし、RTで正確に2分間インキュベートします。
10. 10 mLのRPMI完全培地を加え、チューブを400 x gでRTで8分間遠心分離します。
11. RPMI上清を取り除き、ペレットを破砕し、10 mLのRPMI完全培地で細胞を再懸濁し、CFSE標識K562細胞をカウントします。
12. プレートを300 x gでRTで3分間遠心分離してPBMCを洗浄し、液体をデカントして上清を吸引します。カバーを元に戻し、プレートの底を渦巻きにします。200 μlのRPMI完全培地を加え、洗浄手順をもう一度繰り返します。
13. CFSE標識K562細胞を1:15(100,000 K562s:1.5 x 10⁶ PBMC)の比率でPBMCプレートの各サンプルウェルに添加し、さらに37°Cおよび5%CO₂で5時間インキュベー
トします。
14. 細胞ミックスを300 x gで3分間遠心分離し、室温で洗浄し、液体を捨てて上清を吸引します。カバーを置き、プレートの底を渦巻きます。
15. 200 μlのランニングバッファーを加え、ステップ14で説明した洗浄ステップをもう一度繰り返します。
16. 95 μlのランニングバッファーと5 μlの7AADを各ウェルに加え、合計容量100 μl/ウェルにします。プレートを暗闇で室温で15分間インキュベートします。
17. 各ウェルに100 μlのランニングバッファーを添加し、プレートの各ウェルから全量の細胞懸濁液をクラスターチューブに移し、フローサイトメーターでサンプルを取得します。
18. フローサイトメトリー解析ソフトウェアを使用して、7AAD陽性細胞とCFSE陽性細胞の割合を測定します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
12 X 75チューブ	BDファルコン	352058
15mlコニカルチューブ	コーニング	430790
2 mLマイクロチューブ	アクシゲン	MCT-150-C-S型
50mlコニカルチューブ	コーニング	430828
500mlボトル	コーニング	430282
7AADの	BDファーミンゲン	559925
96ウェルフラットボトムプレート	テルモ・ヌンク	439454
96ウェル丸底板	BDファルコン	353077
細胞培養フード	サーモサイエンティフィック	1300 シリーズ A2
遠心機	エッペンドルフ	58110Rの
CFSEの	分子プローブ ライフテクノロジー	C34554
クラスターチューブ	コーニング	4401	飲み込むと有害、発がん性物質
DMSO(ジメチルスルホキシド)	シグマ・アルドリッチ	D8418
DPBSの	ロンザ	17-512階
FBSの	シグマ・アルドリッチ	F2442
フィルターユニット	ナルゲン	〒156-4020
フローサイトメーター	BDバイオサイエンス	FACSカントII	Ex 405 nmとEm785 nmの8色。
フローサイトメーター	BDバイオサイエンス	FACSカリバー	Ex 495 nmとEm 785 nmの4色。
フローサイトメトリー解析ソフトウェア	ツリースター	フロージョ
ニコチン	シグマ・アルドリッチ	N3876	急性毒性、環境ハザード
パラフィルム	ビーミス	「M」
パラホルムアルデヒド	シグマ・アルドリッチ	P6148	可燃性、皮膚刺激性
ペン/連鎖球菌	ギブコライフテクノロジーズ	15140-122
RPMIの1640	ギブコライフテクノロジーズ	11875-093
ランニングバッファ	MACSランニングバッファー、Miltenyi Biotech	〒130-091-221
トランスファーピペット	フィッシャーサイエンティフィック	13-711-20
トリスベース	シグマ・アルドリッチ	T1503

名 さん 型