出典:Gannon, A. D., et al.緑膿菌感染モデルのリアルタイム評価のためのツール。J. Vis. Exp.(2021年)。
このビデオは、緑膿菌(Pa)凝集体に対する抗菌治療の影響を研究するin vitro技術を示しています。蛍光標識されたPa細胞は、感染時の増殖パターンを模倣して凝集体として増殖します。抗生物質コリスチンの亜致死濃度で凝集体に負荷をかけると、細菌と抗生物質の相互作用のリアルタイム評価が蛍光顕微鏡によって行われます。
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方法論記事
細菌凝集体に対する抗菌処理を研究するためのIn Vitro技術
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2025年7月8日
この記事について
要約
プロトコル
1. 合成嚢胞性線維症培地(SCFM2)を調製します。
>注:SCFM2の準備は、以下に概説する3つの主要な段階で構成されています（図1〉。
- ブタムチンの滅菌
- SCFM2中に最終濃度5 mg / mLの滅菌ムチンを調製します。たとえば、5 mLの容量のSCFM2の場合、滅菌ペトリ皿に25 mgのタイプIIムチンを秤量し、紫外線(UV)滅菌器に4時間入れ、1時間ごとに穏やかに攪拌します。
- 4時間後、UV処理したムチンを無菌条件下でオートクレーブ滅菌した1.7 mLチューブに移し、-20°Cで保存します。
- 完全な滅菌を確認するには、ムチンのサンプルを水やLuria-Bertani(LB)ブロスなどの滅菌液体に溶解し、顕微鏡で観察します
手記：滅菌したムチンは、-20°Cで最大6ヶ月間保存できます。
- 緩衝塩基の調製
- 表1に記載されているように、脱イオン水に適切な量の重量を添加して、塩とアミノ酸のストック溶液を調製します。0.22 μmフィルターを使用してすべてのストック溶液をフィルター滅菌し、光による劣化から保護するためにホイルで包み、4°Cで最大1か月間保存します。
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結果
図1:SCFM2培地の調製と接種。 (A)緩衝塩基は、表1および表2に列挙された塩およびアミノ酸を用いて調製される。緩衝ベースは4°Cで最大30日間保存できますが、光にさらされないように保護する必要があります。(B)ムチンとDNAを緩衝塩基のアリコートに添加し、溶液に4°Cで一晩溶解する。(C)脂質と追加のストックを一晩溶液に加え、37°Cでインキュベートし、250rpmで撹拌しながら20分間インキュベートする。次に、SFCM2にOD600 = 0.05で洗浄した対数期細胞を接種する。略語:SCFM2 =合成嚢胞性線維症痰培地。
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開示事項
利益相反は宣言されていません。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| アミノ酸 | |||
| アラニン | ACRSオーガニックス | 56勝41敗7 | |
| アルギニンHCl | MP(メガピー) | 1119-34-2 | |
| アスパラギン | ACRSオーガニックス | 56勝84敗8 | 0.5 M NaOHで調製 |
| シスチン塩酸塩 | アルファ・アエサル | L06328 | |
| グルタミン酸HCl | ACRSオーガニックス | 138*15*8 | |
| グリシン | ACRSオーガニックス | 56勝40敗6 | |
| ヒスチジンHCl H2O | アルファ・アエサル | A17627 (英語) | |
| イソロイシン | ACRSオーガニックス | 73勝32敗5 | |
| ロイシン | アルファ・アエサル | A12311 (英語) | |
| リジンHCl | アルファ・アエサル | J62099 | |
| メチオニン | ACRSオーガニックス | 63勝68敗3分 | |
| オルニチンHCl | アルファ・アエサル | A12111 (英語) | |
| フェニルアラニン | ACRSオーガニックス | 63勝91敗2分 | |
| プロリン | アルファ・アエサル | A10199 (英語) | |
| セリン | アルファ・アエサル | A11179(英語) | |
| トレオニン | ACRSオーガニックス | 72勝19敗5 | |
| トリプトファン | ACRSオーガニックス | 73勝22敗3 | 0.2 M NaOHで調製 |
| チロシン | アルファ・アエサル | A11141 (英語) | 1.0 M NaOHで調製 |
| バリン | ACRSオーガニックス | 72勝18敗4 | |
| 抗生物質 | |||
| カルベニシリン | アルファ・アエサル | J6194903 | |
| 株式の日 | |||
| CaCl2* 6H2O | フィッシャーケミカル | C79-500 | |
| デキストロース(D-グルコース) | フィッシャーケミカル | 50勝99敗7分 | |
| 1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOPC) | フィッシャー(Avanti Polar Lipids) | 4235-95-4 | 37°Cで15〜20分間振とうし、クロロホルムを蒸発させます |
| FeSO4 * 7H2O | ACRSオーガニックス | 7782-63-0 | このストックは1mg / mLに相当し、新鮮にする必要があります |
| L-乳酸 | アルファ・アエサル | L13242 | NaOHを含むpHストックを7に |
| MgCl2 * 6H2O | ACRSオーガニックス | 7791*18*6 | |
| N-アセチルグルコサミン | TCIの | A0092 | |
| 調製された固形物 | |||
| ブタムチン | シグマ | M1778-100G | UV滅菌 |
| サケの精子DNA | インビトゲン | 15632-011 | |
| 汚す | |||
| ヨウ化プロピジウム | アルファ・アエサル | J66764MC | |
| 塩類 | |||
| K2SO4 | アルファ・アエサル | A13975 の | |
| KClの | アルファ・アエサル | J64189 | バッファリングベースにソリッドを直接追加 |
| ノ・3 | ACRSオーガニックス | 7757-79-1 | |
| モップ | アルファ・アエサル | A12914 (英語) | バッファリングベースにソリッドを直接追加 |
| NaCl | フィッシャーケミカル | S271-500 | バッファリングベースにソリッドを直接追加 |
| Na2HPO4 | RPIの | S23100-500.0 | |
| NaH2PO4 | RPIの | S23120-500.0 | |
| NH4CL | ACRSオーガニックス | 12125 年 02 月 9 | バッファリングベースにソリッドを直接追加 |
| 消耗 品 | |||
| コニカルチューブ(15mL) | オリンパスのプラスチック | 28から101 | |
| コニカルチューブ(50mL) | オリンパスのプラスチック | 28から106 | |
| 培養チューブ、エアフローキャップ付き | オリンパスのプラスチック | 21から129 | |
| 35 mm 4チャンバーガラス底皿 | セルビス | NC0600518 | |
| ルリア・ベルターニ(LB)スープ | ジェネシー・サイエンティフィック | 11〜118 | |
| リン酸緩衝生理食塩水(PBS) | フィッシャーバイオ試薬 | BP2944100 | |
| ピペットチップ(p200) | オリンパスのプラスチック | 23〜150RL | |
| ピペットチップ(p1000) | オリンパスのプラスチック | 23-165RL | |
| 血清ピペット(5 mL) | オリンパスのプラスチック | 12から102 | |
| 血清ピペット(25 mL) | オリンパスのプラスチック | 12〜106 | |
| 血清ピペット(50 mL) | オリンパスのプラスチック | 12〜107 | |
| 超純水(RNAse/DNAseフリー)、ナノ純水 | ジェネシー・サイエンティフィック | 18〜194 | 表1の溶液の調製に使用したナノ純水 |
| シリンジ(10mL) | BDの | 794412 | |
| シリンジ(50mL) | BDの | 309653 | |
| 0.22 mm PESシリンジフィルター | オリンパスのプラスチック | 25から244 | |
| PSキュベット セミマイコ | オリンパスのプラスチック | 91から408 | |
| ソフトウェア | |||
| バイオレンダリング | フィギュアを準備するには | ||
| ファクスディーバ6.1.3 | ベクトン・ディキンソン、カリフォルニア州サンノゼ | ||
| イマリス | ビットプレーン | バージョン 9.6 | |
| ゼンブラック | |||
| 備品 | |||
| ファクスアリアル | ベクトン・ディキンソン、カリフォルニア州サンノゼ | ||
| LSM 880 共焦点レーザー走査型顕微鏡 | ツァイス |
