出典:Gannon, A. D., et al.緑膿菌感染モデルのリアルタイム評価のためのツール。J. Vis. Exp.(2021年)。
このビデオは、緑膿菌(Pa)凝集体に対する抗菌治療の影響を研究するin vitro技術を示しています。蛍光標識されたPa細胞は、感染時の増殖パターンを模倣して凝集体として増殖します。抗生物質コリスチンの亜致死濃度で凝集体に負荷をかけると、細菌と抗生物質の相互作用のリアルタイム評価が蛍光顕微鏡によって行われます。
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方法論記事
細菌凝集体に対する抗菌処理を研究するためのIn Vitro技術
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2025年7月8日
この記事について
要約
プロトコル
1. 合成嚢胞性線維症培地(SCFM2)を調製します。
>注:SCFM2の準備は、以下に概説する3つの主要な段階で構成されています（図1〉。
- ブタムチンの滅菌
- SCFM2中に最終濃度5 mg / mLの滅菌ムチンを調製します。たとえば、5 mLの容量のSCFM2の場合、滅菌ペトリ皿に25 mgのタイプIIムチンを秤量し、紫外線(UV)滅菌器に4時間入れ、1時間ごとに穏やかに攪拌します。
- 4時間後、UV処理したムチンを無菌条件下でオートクレーブ滅菌した1.7 mLチューブに移し、-20°Cで保存します。
- 完全な滅菌を確認するには、ムチンのサンプルを水やLuria-Bertani(LB)ブロスなどの滅菌液体に溶解し、顕微鏡で観察します
手記：滅菌したムチンは、-20°Cで最大6ヶ月間保存できます。
- 緩衝塩基の調製
- 表1に記載されているように、脱イオン水に適切な量の重量を添加して、塩とアミノ酸のストック溶液を調製します。0.22 μmフィルターを使用してすべてのストック溶液をフィルター滅菌し、光による劣化から保護するためにホイルで包み、4°Cで最大1か月間保存します。
- 190 mLの脱イオン水とアミノ酸および塩ストック溶液を表1に示す容量で組み合わせて、緩衝塩基を調製します。溶液をpH 6.8に調整し、最終容量250mLまで増やします。0.22μmフィルターを使用してフィルター滅菌し、4°Cで最大30日間保存します。
- 実験の前夜に、必要な量の緩衝塩基をガラス培養フラスコに分注し、ムチン(ステップ1.1.1で説明したように5 mg / mL)と精製したサケ精子DNA(0.6 mg / mL)を加えます。穏やかに攪拌し、ホイルで包み、4°Cで一晩放置して、ムチンとDNAを溶液に溶解させます
手記：サケの精子DNAアリコートは、氷上で解凍し、ボルテックスし、緩衝塩基とムチンに加える必要があります。トリプトファン、アスパラギン、チロシンのストック溶液は、脱イオン水の代わりにNaOHの溶液(濃度については表1を参照)で調製する必要があります。緩衝ベースとすべてのストック溶液をホイルで包んで保管し、光への曝露から保護します。ほとんどの在庫は最長1か月間安定しています。変色したストックは使用せず、交換してから使用する必要があります。
- 追加在庫の追加
- 実験当日は、表2に示すストックを、ムチンとDNAを含む緩衝塩基に加えます
手記：実験当日に新鮮なFeSO4溶液を準備しますが、他のすべてのストックは事前に作成し、4°Cで30日間保存することができます。取り扱いには注意し、直火の近くでは使用しないでください。DOPCを添加した後、SCFM2を37°Cで振とう(250rpm)しながら少なくとも20分間インキュベートします(5mL培養の場合)。このインキュベーション期間により、DOPC中のクロロホルムが蒸発します。フラスコは気密であってはなりません。代わりに、フラスコの開口部をホイルでゆるく覆います。
- 実験当日は、表2に示すストックを、ムチンとDNAを含む緩衝塩基に加えます
>2. 細菌凝集体中の抗菌耐性のリアルタイム評価
- 一晩で培養を準備する
- 実験の前夜に、抗生物質 (カルベニシリン 300 μg/mL) を含む LB 寒天プレートから Pa PAO1-pMRP9-113 のコロニーを 5 mL に接種します。250rpmで攪拌しながら37°Cで一晩成長します.
手記：必要なプラスミドの選択に必要な抗生物質(ここでは、緑色蛍光タンパク質(GFP)発現プラスミド、pMRP9-1)を添加して、一晩培養します。なお、Pa細胞はSCFM2を接種する前に洗浄する必要があります。LBは、一晩培養するために他の豊富な実験室培地の代わりに使用できます。すべての細菌分離株は、このプロトコル全体で適切なBSL-2ガイドラインを使用して取り扱う必要があります。
- 実験の前夜に、抗生物質 (カルベニシリン 300 μg/mL) を含む LB 寒天プレートから Pa PAO1-pMRP9-113 のコロニーを 5 mL に接種します。250rpmで攪拌しながら37°Cで一晩成長します.
- SCFM2を接種する
- 実験当日、Pa 1:10(培養:液体培地)の培養物を、5mLの新鮮なLBブロスに500μLを接種して、一晩でバック希釈します。250 rpmで攪拌しながら、37°Cで対数期(60〜90分)まで細胞を増殖させます。
- 対数相培養物を10,000 × gで5分間遠心分離し、上清を除去して細胞を洗浄し、ろ過滅菌したリン酸緩衝生理食塩水(PBS、pH 7.0)の3 mLに再懸濁します。これを2回繰り返し、ペレットを最終容量のPBS1mLに再懸濁します。
- 600 nm(OD600)の分光光度計を使用して洗浄した細胞の吸光度を測定し、5 mLのSCFM2で0.05の開始OD600に必要な培養量を計算します。PaをSCFM2に接種し、穏やかにボルテックスして細胞全体に分布させます。接種したSCFM2 1 mLを4ウェルガラス底の光学皿の各チャンバーにピペットで移し、37°Cで4時間静的にインキュベートします
手記：Pa培養物の倍加時間は、菌株と酸素の利用可能性に依存します。SCFM2では、ここで説明した条件下で、Paの倍加時間は~1.4時間です。
3. 共焦点レーザー走査型顕微鏡(CLSM)による抗生物質治療中の凝集体の可視化
>注:このセクションでは、SCFM2のPa凝集体のイメージングのための共焦点レーザー走査型顕微鏡と画像キャプチャソフトウェアの使用について説明します。目標は、抗生物質による処理後に残っている(耐性のある)細菌バイオマスを観察し、特徴付けることです。概説した手順は、他の共焦点顕微鏡でも問題なく実行できますが、具体的なガイダンスについては、機器の操作マニュアルを参照する必要があります。
- 加熱チャンバーまたは顕微鏡ステージに取り付けられた加熱マイクロプレートのいずれかを使用して、周囲温度を37°Cに維持し、実験開始の少なくとも2時間前にインキュベーションモジュールを開始して、すべての装置が所望の温度に到達できるようにし、データ収集中のさらなる拡張と移動を減らします。
- 4時間後、Pa細胞を含むSCFM2培養物を加熱した顕微鏡ステージに移します。4 つのウェルのうち 3 つを抗生物質治療の技術的レプリケートとして指定し、4 番目のウェルを SCFM2 の Pa 細胞のみを含み、抗生物質を含まない無処理コントロールと見なします。蛍光レポーターを励起する前に、Locateタブ内の明視野顕微鏡を使用して凝集体を同定します。各ウェル内のイメージング領域を定義し、イメージングソフトウェアのPositionsモジュールを使用してその位置(x-y-z座標)を保存します。
- 63倍油浸対物レンズを使用して、励起波長488 nm、発光波長509 nmのSCFM2にGFP発現プラスミドpMRP9-1を含むPa培養物を可視化します。Acquisitionモジュール内のz-stackオプションを使用して、1 μm間隔で画像を撮影します(合計60スライス)。 ライン平均化モジュールを使用して、60 μm zスタック画像(1,093.5 mm3)の総体積内でGFPチャネルのバックグラウンド蛍光を低減します。画像解析のための背景蛍光を決定するために同一の設定を使用して、未接種SCFM2の制御画像を撮影します.
手記：画像は、カバーガラスの基部から 60 μm の位置にある 512 ピクセル x 512 ピクセル (0.26 μm x 0.26 μm ピクセル) の 8 ビット z スタック画像を生成することによって取得されます。 - イメージングソフトウェア内の時系列オプションを使用して、18時間にわたって15分間隔で各位置(ウェル)で60スライスをキャプチャします。
- 合計4.5時間のインキュベーション後、上記の設定を使用して各位置を画像化し、抗生物質を添加する前の4つのウェルのそれぞれ内の凝集バイオマスを決定します。
- 全インキュベーションの6時間後、各リピートに最小阻害濃度(MIC)を2倍未満で抗生物質を添加します。ウェルの中央、気液間相のすぐ下にピペットで直接かつ静かにピペットで入れます。加熱された共焦点チャンバーですべての培養物を維持します.
手記：ここでは、140 μg/mL の濃度の硫酸コリスチンを使用しました。 - イメージングプログラム内の[実験の開始]オプションをクリックして、抗生物質治療後のイメージングを開始します.
手記：使用される抗生物質の濃度は、抗生物質、Pa分離株、およびユーザーが殺傷効果または耐性効果を調べたいかどうかによって異なります。この実験では、単回投与を使用します。必要に応じて、培養を中断することなく追加の用量を追加できます。
4. Pa凝集体のヨウ化プロピジウム
染色>注:ヨウ化プロピジウム(PI)は、培養中の生存不能な(死んだ)細菌細胞を特定するための染色試薬として一般的に利用されています。ここでは、セクション3で適用された抗生物質処理に敏感な凝集体を特定するために使用されます。このプロトコール全体を通じて、Pa細胞におけるGFPの発現および検出は、細胞生存率の主要なプロキシとして使用されます。この最後のステップにより、共焦点イメージングを再度使用して、生/死骨材の相互の空間的位置を特定することができます。さらに、凝集体は、セクション3でさらに下流の細胞を選別するために生/死として識別されます。
- 18時間後、SCFM2培養物を含む4チャンバー光学ボトムディッシュの各ウェルにPIを添加します。PIの量とインキュベーション時間については、製造元の指示に従ってください(例:培養1mLあたり~2μL、~20-30分)。
5. Fluorescence-activated cell sorting (FACS) アプローチを用いた凝集体からの生細胞の単離
>注:FACSは、蛍光タグ付きの表現型に従って細胞のグループを選別および分離するための強力なプラットフォームを提供します。ここでは、FACSを使用して、生存不能な凝集体から生きた(抗生物質耐性のある)凝集体を分離します。
- ヨウ化プロピジウムで染色した後、培養物をインキュベーションから取り出し、断熱容器内のFACS装置に移して37°Cを維持します。
- Pa 凝集体を含む SCFM2 の 1 mL アリコートを最低流速で泳動します
手記：各アリコートには~15,000個の骨材が含まれます。 - GFPを検出するには、488 nmのレーザーで細胞を照射し、530/30 nmの蛍光シグナルの高さを記録します。561 nmレーザーによる励起によるPI染色を可視化し、610/20 nmでの蛍光シグナルの高さを記録します。70-uノズルを使用して選別を行います.
手記： ソートされたアグリゲートは、ユーザーのアプリケーションに応じて複数の方法でプールできます。この場合、FACSを使用して、下流のRNAシーケンシングのために生存可能なPa凝集体をソーティングしました。
>表1:合成嚢胞性線維症喀痰培地SCFM2の緩衝塩基に必要な塩、アミノ酸、DNA、およびムチンストックの調製。
の の 名| ケミカル | 原液濃度(M) | 最終濃度(mM) | 筆記 |
| NaH2PO4 | 0.2 | 1.3 | |
| Na2HPO4 | 0.2 | 1.25 | |
| ノ・3 | 1 | 0.35 | |
| K2SO4 | 0.25 | 0.27 | |
| NH4CL | 2.28 | バッファリングベースにソリッドを直接追加 | |
| KClの | 14円94銭 | バッファリングベースにソリッドを直接追加 | |
| NaCl | 51円85銭 | バッファリングベースにソリッドを直接追加 | |
| モップ | 10 | バッファリングベースにソリッドを直接追加 | |
| シリーズ | 0.1 | 1.45 | |
| グルHCl | 0.1 | 1.55 | |
| プロ | 0.1 | 1.66 | |
| グリー | 0.1 | 1.2 | |
| 翼 | 0.1 | 1.78 | |
| ヴァル | 0.1 | 1.12 | |
| 会った | 0.1 | 0.63 | |
| イル | 0.1 | 1.12 | |
| ルー | 0.1 | 1.61 | |
| オーンHCl | 0.1 | 0.68 | |
| リスHCl | 0.1 | 2.13 | |
| Arg HCl | 0.1 | 0.31 | |
| TRPの | 0.1 | 0.01 | 0.2 M NaOHで調製 |
| ASPの | 0.1 | 0.83 | 0.5 M NaOHで調製 |
| ティル | 0.1 | 0.8 | 1.0 M NaOHで調製 |
| サー | 0.1 | 1.07 | |
| Cys HCl | 0.1 | 0.16 | |
| ペー | 0.1 | 0.53 | |
| 彼のHCl H2O | 0.1 | 0.52 | |
| サケの精子DNA | 0.6 mg/mL | ||
| ブタムチン | 5 mg/nL |
>表2:合成嚢胞性線維症痰培地SCFM2の緩衝塩基に必要な追加ストックの調製。
の| ケミカル | 原液濃度(M) | 最終濃度(mM) | 筆記 |
| デキストロース(D-glu2cose) | 1 | 3 | |
| L-乳酸 | 1 | 9.3 | NaOHでpH 7.0に調整 |
| CaCl2*H2O | 1 | 1.75 | |
| MgCl2*6H2O | 1 | 0.61 | |
| FeSO4*7H2O | 1 mg/mL | 0.0036 | 毎日新鮮に |
| N-アセチルグルコサミン | 0.25 | 0.3 | |
| 1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOPC) | 25 mg / mL | 100 μg/mL | 添加後、37°Cで少なくとも20分間インキュベートします |
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結果
図1:SCFM2培地の調製と接種。 (A)緩衝塩基は、表1および表2に列挙された塩およびアミノ酸を用いて調製される。緩衝ベースは4°Cで最大30日間保存できますが、光にさらされないように保護する必要があります。(B)ムチンとDNAを緩衝塩基のアリコートに添加し、溶液に4°Cで一晩溶解する。(C)脂質と追加のストックを一晩溶液に加え、37°Cでインキュベートし、250rpmで撹拌しながら20分間インキュベートする。次に、SFCM2にOD600 = 0.05で洗浄した対数期細胞を接種する。略語:SCFM2 =合成嚢胞性線維症痰培地。
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開示事項
利益相反は宣言されていません。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| アミノ酸 | |||
| アラニン | ACRSオーガニックス | 56勝41敗7 | |
| アルギニンHCl | MP(メガピー) | 1119-34-2 | |
| アスパラギン | ACRSオーガニックス | 56勝84敗8 | 0.5 M NaOHで調製 |
| シスチン塩酸塩 | アルファ・アエサル | L06328 | |
| グルタミン酸HCl | ACRSオーガニックス | 138*15*8 | |
| グリシン | ACRSオーガニックス | 56勝40敗6 | |
| ヒスチジンHCl H2O | アルファ・アエサル | A17627 (英語) | |
| イソロイシン | ACRSオーガニックス | 73勝32敗5 | |
| ロイシン | アルファ・アエサル | A12311 (英語) | |
| リジンHCl | アルファ・アエサル | J62099 | |
| メチオニン | ACRSオーガニックス | 63勝68敗3分 | |
| オルニチンHCl | アルファ・アエサル | A12111 (英語) | |
| フェニルアラニン | ACRSオーガニックス | 63勝91敗2分 | |
| プロリン | アルファ・アエサル | A10199 (英語) | |
| セリン | アルファ・アエサル | A11179(英語) | |
| トレオニン | ACRSオーガニックス | 72勝19敗5 | |
| トリプトファン | ACRSオーガニックス | 73勝22敗3 | 0.2 M NaOHで調製 |
| チロシン | アルファ・アエサル | A11141 (英語) | 1.0 M NaOHで調製 |
| バリン | ACRSオーガニックス | 72勝18敗4 | |
| 抗生物質 | |||
| カルベニシリン | アルファ・アエサル | J6194903 | |
| 株式の日 | |||
| CaCl2* 6H2O | フィッシャーケミカル | C79-500 | |
| デキストロース(D-グルコース) | フィッシャーケミカル | 50勝99敗7分 | |
| 1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOPC) | フィッシャー(Avanti Polar Lipids) | 4235-95-4 | 37°Cで15〜20分間振とうし、クロロホルムを蒸発させます |
| FeSO4 * 7H2O | ACRSオーガニックス | 7782-63-0 | このストックは1mg / mLに相当し、新鮮にする必要があります |
| L-乳酸 | アルファ・アエサル | L13242 | NaOHを含むpHストックを7に |
| MgCl2 * 6H2O | ACRSオーガニックス | 7791*18*6 | |
| N-アセチルグルコサミン | TCIの | A0092 | |
| 調製された固形物 | |||
| ブタムチン | シグマ | M1778-100G | UV滅菌 |
| サケの精子DNA | インビトゲン | 15632-011 | |
| 汚す | |||
| ヨウ化プロピジウム | アルファ・アエサル | J66764MC | |
| 塩類 | |||
| K2SO4 | アルファ・アエサル | A13975 の | |
| KClの | アルファ・アエサル | J64189 | バッファリングベースにソリッドを直接追加 |
| ノ・3 | ACRSオーガニックス | 7757-79-1 | |
| モップ | アルファ・アエサル | A12914 (英語) | バッファリングベースにソリッドを直接追加 |
| NaCl | フィッシャーケミカル | S271-500 | バッファリングベースにソリッドを直接追加 |
| Na2HPO4 | RPIの | S23100-500.0 | |
| NaH2PO4 | RPIの | S23120-500.0 | |
| NH4CL | ACRSオーガニックス | 12125 年 02 月 9 | バッファリングベースにソリッドを直接追加 |
| 消耗 品 | |||
| コニカルチューブ(15mL) | オリンパスのプラスチック | 28から101 | |
| コニカルチューブ(50mL) | オリンパスのプラスチック | 28から106 | |
| 培養チューブ、エアフローキャップ付き | オリンパスのプラスチック | 21から129 | |
| 35 mm 4チャンバーガラス底皿 | セルビス | NC0600518 | |
| ルリア・ベルターニ(LB)スープ | ジェネシー・サイエンティフィック | 11〜118 | |
| リン酸緩衝生理食塩水(PBS) | フィッシャーバイオ試薬 | BP2944100 | |
| ピペットチップ(p200) | オリンパスのプラスチック | 23〜150RL | |
| ピペットチップ(p1000) | オリンパスのプラスチック | 23-165RL | |
| 血清ピペット(5 mL) | オリンパスのプラスチック | 12から102 | |
| 血清ピペット(25 mL) | オリンパスのプラスチック | 12〜106 | |
| 血清ピペット(50 mL) | オリンパスのプラスチック | 12〜107 | |
| 超純水(RNAse/DNAseフリー)、ナノ純水 | ジェネシー・サイエンティフィック | 18〜194 | 表1の溶液の調製に使用したナノ純水 |
| シリンジ(10mL) | BDの | 794412 | |
| シリンジ(50mL) | BDの | 309653 | |
| 0.22 mm PESシリンジフィルター | オリンパスのプラスチック | 25から244 | |
| PSキュベット セミマイコ | オリンパスのプラスチック | 91から408 | |
| ソフトウェア | |||
| バイオレンダリング | フィギュアを準備するには | ||
| ファクスディーバ6.1.3 | ベクトン・ディキンソン、カリフォルニア州サンノゼ | ||
| イマリス | ビットプレーン | バージョン 9.6 | |
| ゼンブラック | |||
| 備品 | |||
| ファクスアリアル | ベクトン・ディキンソン、カリフォルニア州サンノゼ | ||
| LSM 880 共焦点レーザー走査型顕微鏡 | ツァイス |
