コロニー形成ユニットアッセイによる宿主細胞における細菌感染の定量化

要約

出典:Gayle, P. et al., 細菌性病原体を使用して細胞および生物レベルの宿主応答をプローブする。J. Vis. Exp.(2019年)。

このビデオは、コロニー形成単位アッセイによってマクロファージのリステリア菌感染を測定するためのin vitro定量技術を示しています。寒天プレート上の細菌コロニーは、宿主防御機構を逃れてマクロファージ内で生存する細胞内細菌集団を表しています。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 感染のための細胞の準備

1. 125 mLフラスコと37°C/5% CO₂に維持された組織培養インキュベーターを使用して、10%ウシ胎児血清(以下、DMEM/FCSと呼ぶ)を添加したDMEM組織培養培地で、マウスマクロファージ様細胞株RAW 2を増殖させます。
2. 感染の前日に、セルスクレーパーを使用して拡張フラスコから細胞を取り出し、15mLのスクリューキャップコニカルチューブに収集します。細胞を800 x gで10分間遠心分離し、上清をデカントし、細胞ペレットを1 mLのDMEM/FCS(抗生物質なし)に懸濁し、血球計算盤または自動セルカウンターを使用して力価を測定します。
3. 力価を2 x 10⁶細胞/mLに調整し、0.10 mL(2 x 10⁵細胞)を48ウェル組織培養皿のウェルに加えます。セル懸濁液がウェルの表面全体を覆っていることを確認します。
   1. 追加のウェルで細胞をプレート化し、後でコンディショニング培地の供給源にします。また、0.10 mLのDMEM/FCSを3つのウェルに追加のウェルに入れ、「細胞なしコントロール」として使用します。
4. 組織培養インキュベーターで37°C/5%CO₂で一晩インキュベートします。翌日、細菌の接種物が準備され、使用できるようになるまで、インキュベーターから取り出さないでください。

2. リステリア菌(Lm)の感染準備

1. 2 mLの脳心注入(BHI)に、新たに縞模様の寒天プレート(<2日間)から1つのコロニーを接種し、130回転/分で振とうしながら37°Cで一晩インキュベー
トします。
2. 翌日、予熱した2 mLのBHIに0.10 mLの一晩培養物を加え、光学密度(OD₆₀₀)が0.4〜0.6になるまで振とうしながら37°Cでインキュベートを続けます。
3. 経験的に導出された変換式を使用して、おおよその細菌力価を決定します。私たちの研究室では、BHIで指数関数的に成長するLm培養物は、約1.3 x 10⁹コロニー形成単位(CFU)/_OD600です。細菌培養物が室温にさらされる時間を最小限に抑えます。
4. 感染の直前に、あらかじめ温めたDMEM/FCSを希釈剤として使用して、力価を5 x 10⁷ CFU/mLに調整します。

3. 感染

1. 迅速かつ正確に作業するには、新たに調製したLm接種物(上記のステップ2.4)の20 μL(1 x 10⁶ CFU;感染の多様性、MOI = 5)をウェルに加えます。ディッシュをわずかに傾け、ピペットチップを上にある培地に慎重に置きます;
   注意: ピペットの先端でウェルの壁に触れないでください。
2. 各ウェルの内容物を静かにピペットで動かして、完全に混合されるようにします。プレートを振ったり、大きく傾けたりしないでください。これにより、ウェルの壁にLmが広がります。細胞培養皿を37°C/5%_CO2インキュベーターに戻します。
3. 10 μg/mLのゲンタマイシン溶液を調製し、未感染ウェルのコンディショニング培地を希釈剤として使用します。
4. 感染後30分(mpi)で、ゲンタマイシン溶液30 μL(最終濃度2.5 μg/mL)を慎重に添加し、ウェルの内容物を前と同じように穏やかにピペットで移し、細胞培養皿を37 °C/5% CO₂インキュベーターに戻します。
5. 60 mpi で、CFU アッセイ(60 mpi 時点)または FCM 分析(以下のセクション 4 と 5 でそれぞれ説明)のいずれかに適したウェルを回収します。
6. 残りのウェルについては、その後の様々な時期に、以前と同様に細胞を回収するか、またはLm創発アッセイのために、培地をウェルから完全に除去し、それを150μLのゲンタマイシンフリー馴化培地と交換する。

4. CFUアッセイによる細胞内および創発Lmのサンプリング処理と解析

1. 収穫するには、皿を少し傾けて、ウェルからメディア全体を慎重に取り出します。0.50 mLの蒸留滅菌水(dsH₂O)をウェルに加えます。30秒後、得られた水溶解物(10⁰)を1.5 mLの微量遠心チューブに移し、10秒間激しくボルテックスします。
2. 4.5 μL または 50 μL の水溶解液を 450 μL の dsH₂O に加えて ^10-1 および ^10-2 希釈液を調製し、短時間ボルテックスして完全に混合します。
3. ^{10 0}、^10-1、および/または^10-2のサンプル50 μLをライソジェニーブロス(LB)寒天プレートに広げます。
4. 創発性Lmをアッセイするには(上記のステップ3.6)、オーバーレイ培地10 μLを取り出し、2つの5 μLアリコートに分割します:1つのアリコートに5 μLのDMEM/FCSを添加し、2番目のアリコートに5 μg/mLのゲンタマイシンを含むDMEM/FCSを5 μL追加します。後者のコントロールは、その後のCFUアッセイで細胞外Lm(ゲンタマイシン感受性)と細胞内Lm(ゲンタマイシン耐性)を区別します。
5. 室温で5分後、90 μLのdsH₂Oを加え、10秒間激しくボルテックスし、50 μLをLB寒天プレートに広げます。
6. 37°Cで2日間のインキュベーション後、LB寒天プレート上のLmコロニーを列挙します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
BHI(Brain Heart Infusion)ブロス	EMDミリポア	110493
DMEMメディア	ギブコ	11965-092
FBS - ヒート不活性化	シグマ・アルドリッチ	F4135-500ミリリットル
LB寒天	グローセルMS	MBPE-4040
TPP組織培養48ウェルプレート	ミッドシ	TP92048