In vitroでの細胞内および新興細胞外リステリア菌のフローサイトメトリー解析

要約

出典:Gayle, P. et al., Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses. J. Vis. Exp. (2019)

この動画では、細胞内病原菌であるリステリア菌が培養マクロファージに感染した後、フローサイトメトリーを用いて細胞内および細胞外リステリア菌を定量しています。

プロトコル

1. フローサイトメトリー(FCM)による細胞内および創発的Lmのサンプリング処理と解析

1. 10%ウシ胎児血清(以下、DMEM/FCS)を添加したDMEM組織培養培地で、125 mLフラスコと37°C/5%_CO2に維持された組織培養インキュベーターを使用して、マウスマクロファージ様細胞株RAW 2を調製します。細胞を1 x 10⁶細胞/mLに調整し、1 mL(1 x 10⁶細胞)を6ウェル組織培養皿のウェルに加えます。
2. リステリア菌、Lm、細菌接種物を調製し、MOI50(5 x 10⁷ CFU)に対応する接種量の細胞を感染させます。
3. 感染後1.5時間(hpi)で、最初のウェルセットから培地を採取し、500μLの4%パラホルムアルデヒド(PFA)を入れた1.5mLの微量遠心チューブに入れ、すべてのウェルが処理されるまで氷上に置きます。
4. 細胞内Lmを回収するには、1 mLのds H₂Oをウェルに添加し、60秒後に得られた水ライセートを500 μLの4% PFAを含む1.5 mLの微量遠心チューブに移します。10秒間激しく渦巻き、すべてのウェルが処理されるまで氷の上に置きます。
5. 残りのウェルについては、培地を取り出し、1 mLのDMEM/FCSと5 μg/mLのゲンタマイシンに交換して細胞外Lmを死滅させ、細胞をインキュベーターに速やかに戻します。
6. 30分後(2 hpi)メディアを取り出し、ゲンタマイシンを含まないDMEM / FCSと交換します。.
7. 2時間後と4時間後(4時間および6時間)に、培地と溶解物を収集して2番目と3番目のタイムポイントを取ります。
8. チューブを10,000 x gで7分間遠心分離し、ペレットを乱さずに上清を除去します。
9. 各ペレットを50 μLの4% PFAと15 μLのファロイジンの染色カクテルに懸濁します。チューブを暗所4°Cで20分間インキュベートします。
10. インキュベーション後、各チューブに1 mLのFACSバッファーを加え、ピペットで上下に動かして混合します。
11. 10,000 x gでチューブを7分間スピンし、ペレットを乱さずに上清を除去します。
12. 各ペレットを400 μLのFACSバッファーに懸濁してすぐに使用するか、200 μLのFACSバッファーと200 μLの4% PFAで保存して後で分析します。
13. フローサイトメトリーでサンプルを泳動し、収集したデータを解析します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
BHI(Brain Heart Infusion)ブロス	EMDミリポア	110493
セルストレーナー、70 μm	VWRの	10199-656
コラゲナーゼD	ロシュ	11088858001
DMEMメディア	ギブコ	11965-092
FACSチューブ	BDファルコン	352054
FBS - ヒート不活性化	シグマ・アルドリッチ	F4135-500ミリリットル
ハンクスのバランスの取れた塩溶液	シグマ・アルドリッチ	H6648-6×500MLまで
LB寒天	グローセルMS	MBPE-4040
LIVE/DEAD 固定可能 イエローデッドセルステインキット	ライフテクノロジー	L349S9
ローダミンファロイジン	サーモフィッシャー	R415
SP6800 スペクトラルアナライザ	ソニー
TPP組織培養48ウェルプレート	ミッドシ	TP92048
TPP組織培養用6ウェルプレート	ミッドシ	TP92406

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