ナノインジェクターを用いたハエへの細菌懸濁液の感染

要約

出典:Khalil, S. et al., ショウジョウバエの全身性細菌感染と免疫防御表現型.J. Vis. Exp.(2015年)

このビデオは、ハエの体腔に細菌懸濁液をナノ注入し、細菌の増殖と感染を引き起こすことを示しています。ハエの免疫反応は一部の細菌を一掃しますが、他の細菌は免疫クリアランスを逃れて宿主内で生存し、感染を引き起こします。

プロトコル

1. ハエを集めて準備する

1. Drosophila melanogasterを所望の実験条件下で後退させる。飼育中にハエが過密にならないように注意し、幼虫期の環境条件が成虫期の免疫防御表現型に大きく影響する可能性があるため、幼虫の密度が治療間で一貫していることを確認してください。
2. 蛹ケースから脱皮後0〜3日で実験ハエを採取し、新鮮な培地に移します。
3. 収集したハエを希望の温度(一般的には22°Cから28°Cの温度が適切)で、卵後5〜7日で熟成させるまで保管します><。 手記：これにより、ハエが変態を完了して成熟した成虫になるのに十分な時間を確保できますが、老化が始まるかなり前です。
4. 感染する前に、必要な数のハエを別のバイアルに分類し、過密を避けるように再度注意してください。
   手記：このデモンストレーションではオスのみが感染しますが、説明されている手順を使用してメスに感染させることも同様に可能です。

2. 細菌の培養と調製

1. 感染の少なくとも2日前に、選択した細菌のマスタープレートを準備します。-80°Cで無期限に保存した15%グリセロールストックからバクテリアをストリークし、マスタープレートを4°Cで最大2週間保存します。マスタープレートは常に冷凍グリセロールストックから直接ストリークします。培養物で細菌が繰り返し通過すると、細菌が弱毒化した病原性を進化させる可能性があるため、プレートからプレートへの細菌の連続的な通過は避けてください。
   手記：この例では、Providencia rettgeri と Escherichia coli を利用しています。
2. 次の手順を使用して、注射用の細菌懸濁液を準備します。
   1. マスタープレートから分離された単一のコロニーを滅菌培地に接種することにより、2 mLの細菌培養物を増殖させます。細菌を固定相まで増殖させます(例:37°CでのO / N成長)。
      手記： P. rettgeri と E. coli はどちらも、20 から 37 °C の温度で Luria Broth で穏やかに振るとよく育ちます。
   2. 培養液が固定相に達したら、培養液約600μlの細胞を卓上遠心分離機(5,000 x gで3分間)で穏やかにペレット化し、上清を廃棄し、約1,000 μlの滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS;137 mM塩化ナトリウム、NaCl、2.7 mM塩化カリウム、 KCl、10 mMリン酸ナトリウム、Na₂PO₄、1.8 mMリン酸二水素カリウム、KH₂PO₄、pH = 7.4)。
   3. 再懸濁した細胞を滅菌PBSで希釈して、使用する細菌に適した光学密度(OD)を達成し、600nmの吸光度として分光光度計で測定します。この懸濁液を使用してハエに感染させます。
      手記：₆₀₀ = 0.1または1.0は、それぞれ約10⁸および10⁹ Providencia rettgeriまたは大腸菌/mlに対応します。生菌と死菌の両方が光学密度に寄与するため、細菌の死体が蓄積して光学密度と感染中に導入される生菌の数との関係が歪む前に、固定相の早い段階で培養物を採取することが重要です。

3. ハエを感染させる

>注:ショウジョウバエの免疫は概日リズムの影響を受けるため、実験の反復間で同様の時間帯に感染を行うことが重要です。

1. ナノインジェクターの使用
   1. ガラス針を感染に備えます。
      1. マイクロピペットプーラーを使用してホウケイ酸ガラスキャピラリーを引っ張ってガラス針を準備します。
      2. 鉗子を使用して、針の先端を折って直径約50μmの開口部を作り、液体を排出できるようにします。
   2. インジェクターを組み立てます。
      1. シーリングOリングを取り付け、次に白いスペーサー(外側を向いた大きなくぼみ)を金属製のプランジャーに置きます。
      2. 30Gの針が付いた注射器を使用して、ガラス針に鉱油を入れます。
      3. 充填されたガラス針をコレットに通し、次に、針の鈍い端から約1mmのベースの周りに大きい方のOリングを配置します。
      4. 針を金属製のプランジャーにスライドさせ、固定されるまでコレットをそっとねじ込みます。
      5. インジェクターからほとんどの鉱油を排出しますが、インジェクターと細菌懸濁液の間のバリアとして機能するために、針にまだ少量のオイルがあることを確認してください。鉱油または細菌懸濁液内、または2つの液体の間に気泡がないことを確認してください。
      6. インジェクターを注入に必要な容量(9 nl〜50 nl)に設定します。
   3. 負傷コントロールを生成します。
      1. 毛細血管針の先端をメディアのチューブに慎重に挿入し、インジェクターの「充填」ボタンを押して、インジェクター針に滅菌PBSを充填します
         手記：無菌細菌増殖培地は、実験で増殖培地に懸濁した細菌の注射が必要な場合、創傷制御としても使用できます。しかし、細菌増殖培地には、免疫系を刺激したり、宿主に他の影響を与える可能性のある成分が含まれているため、PBSなどの不活性キャリアが好ましい。
      2. 二酸化炭素(CO₂)の軽い流れの下で、必要な数のハエを麻酔します。
      3. 腹外側表面の前方腹部にハエに滅菌PBSを注入します。
         手記：胸部の胸骨プレートなど、他の部位にハエを注入することも可能ですが、各実験内で注射部位を一定に保つことが重要です。
      4. 注入したハエを新しい培地で新鮮なバイアルに入れ、すべてのハエが麻酔から回復するまでバイアルを横にして、ハエが食物にくっつくのを防ぎます。
         手記：実験用ハエに細菌を注入する前にPBSコントロールハエを注射して、両方の治療に同じ針を使用できるようにすることをお勧めします。実験全体で同じ針を使用できるとは限りません。その場合、どの針がどのハエに使用されたかを記録し、統計分析の実験要素として針の同一性を含めることが望ましい場合があります。
   4. 細菌性病原体を注入します。
      1. 残りの滅菌培地をインジェクターから排出し、同じ針に細菌懸 ?? 液を補充します。.
      2. 上記の手順(3.1.3)を繰り返し、手順2.2で調製した細菌懸濁液をハエに注入します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
孵卵器	パワーズサイエンティフィック株式会社	DROS52SD
絵筆
CO2フライパッド	フライスタッフ	59〜114
CO2	エアガス	CD FG50
ショウジョウバエ飼育ミックス
顕微鏡	オリンパス株式会社	SZ51
ショウジョウバエバイアルポリスチレン	VWRインターナショナル	89092-720
Nosterile大型コットンボール	フィッシャーブランド	22-456-883
透明な蓋付きシャーレ、隆起した隆起した隆起; 100 . x 15 mm;	VWRインターナショナル	25384-302
LB寒天、ミラー	ディフコ	244520
接種ループ	VWRインターナショナル	80094から488
レイニン クラシックピペット さまざまなサイズ 0.1 μl から 2 μl, 2 μl から 20 μl, 20 μl から 200 μl, 100μlから1000	レイニン	PR-2 PR-20 PR-200 PR-1000
マイクロピペットチップ(各種サイズ)	VWRインターナショナル	30128-376 53503-810 16466-008
ルリアブロスベース、ミラー	ディフコ	241420
使い捨て培養チューブホウケイ酸ガラス	VWRインターナショナル	47729から576
S-500 オービタルシェイカー	VWRインターナショナル	14005-830
遠心機	VWRインターナショナル	37001-300
PBSのpH 7.4 10x	インビトゲン	70011044
SmartSpec 3000分光光度計	バイオ・ラッド	〒170-2501
セミマイクロボリュームキュベット	バイオ・ラッド	〒223-9955
垂直キャピラリープーラー	Kopf ニードルピペットプーラー
3.5インチナノジェットII用の交換用ガラスキャピラリー	ドラモンド・シエンティフィック・カンパニー	3-000-203-G/X
ナノジェクトII	ドラモンド・シエンティフィック・カンパニー	3-000-204
鉗子	ファインサイエンスツール	11255から20
10mLシリンジ	BDの	309604
ミネラルオイル、ホワイト、ライト	マクロンファインケミカルズ	6358から10
1.5mLマイクロ遠心チューブ;シールライト	USAサイエンティフィック社	1615-5500