ハエに全身性細菌感染を導入するための敗血症性ピンプリック技術

要約

出典:Khalil, S., et al.ショウジョウバエメラノガスターにおける全身性細菌感染と免疫防御表現型。J. Vis. Exp.(2015年)

このビデオは、病原菌を直接体腔内に導入することでショウジョウバエに感染させる技術を示しています。この方法は、上皮バリアやその他の受動的な防御メカニズムをバイパスし、全身感染の誘発を可能にします。感染すると、結果として生じる免疫応答は、ハエの死亡率を監視し、下流のアッセイを行うことによって評価されます。

プロトコル

1. ハエを集めて準備する

1. D.メラノガスターを所望の実験条件下で後部。飼育中にハエが過密にならないように注意し、幼虫期の環境条件が成虫期の免疫防御表現型に大きく影響する可能性があるため、幼虫の密度が治療間で一貫していることを確認してください。
2. 蛹ケースから脱皮後0〜3日で実験ハエを採取し、新鮮な培地に移します。
3. 収集したハエを希望の温度(一般的には22°Cから28°Cの温度が適切)で、卵後5〜7日で熟成させるまで保管します><。 手記：これにより、ハエが変態を完了して成熟した成虫になるのに十分な時間を確保できますが、老化が始まるかなり前です。
4. 感染する前に、必要な数のハエを別のバイアルに分類し、過密を避けるように再度注意してください。
   手記：このデモンストレーションではオスのみが感染しますが、説明されている手順を使用してメスに感染させることも同様に可能です。

2. 細菌の培養と調製

1. 感染の少なくとも2日前に、選択した細菌のマスタープレートを準備します。-80°Cで無期限に保存した15%グリセロールストックからバクテリアをストリークし、マスタープレートを4°Cで最大2週間保存します。マスタープレートは常に冷凍グリセロールストックから直接ストリークします。培養物で細菌が繰り返し通過すると、細菌が弱毒化した病原性を進化させる可能性があるため、プレートからプレートへの細菌の連続的な通過は避けてください。
   手記： この例では、Providencia rettgeri と Escherichia coli を利用しています。
2. 次の手順を使用して、注射用の細菌懸濁液を準備します。
   1. マスタープレートから分離された単一のコロニーを滅菌培地に接種することにより、2 mLの細菌培養物を増殖させます。細菌を固定相まで増殖させます(例:37°CでのO / N成長).
      手記： P. rettgeri と E. coli はどちらも、20 から 37 °C の温度で Luria Broth で穏やかに振るとよく育ちます。
   2. 培養液が固定相に達したら、培養液約600μlの細胞を卓上遠心分離機(5,000 x gで3分間)で穏やかにペレット化し、上清を廃棄し、約1,000 μlの滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS;137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na₂PO₄)に細菌を再懸濁します。 1.8 mM KH₂PO₄, pH = 7.4)。
   3. 再懸濁した細胞を滅菌PBSで希釈して、使用する細菌に適した光学密度(OD)を達成し、600nmの吸光度として分光光度計で測定します。この懸濁液を使用してハエに感染させます.
      手記：A600 = 0.1または1.0は、それぞれ約10⁸および10⁹ Providencia rettgeriまたは大腸菌/mlに対応します。生菌と死菌の両方が光学密度に寄与するため、細菌の死体が蓄積して光学密度と感染中に導入される生菌の数との関係が歪む前に、固定相の早い段階で培養物を採取することが重要です。

3. ハエを感染させる

>注:ショウジョウバエの免疫は概日リズムの影響を受けるため、実験の反復間で同様の時間帯に感染を行うことが重要です。

1. セプティックピンプリック付き
   1. 刺すための針を準備します。
      1. 200 μLのマイクロピペットチップの端を溶かし、0.15 mmの昆虫用微細ピンを溶融プラスチックに挿入します。プラスチックが固化し、ピンがプラスチックから約0.5cm伸びた状態でピンが所定の位置に保持
      されるようにします。
   2. 負傷コントロールを生成します。
      1. CO₂の軽い流れの下で必要な数のハエを麻酔します。
      胸
      2. 部の胸骨胸膜板にハエを針で刺し、翼と脚の付着部位を避けます。必要に応じて、柔らかい鉗子を使用して、ハエを微細ピンからそっと取り除きます
         手記：ハエを腹外側表面の前面前腹部など、他の部位に刺すことも可能ですが、各実験内で注射部位を一定に保つことが重要です。腹部のキューティクルを刺すことは、胸部を刺すことよりも難しい傾向があるため、あまり一般的ではありません。
      3. 刺したハエを新しいハエ用培地を入れた新しいバイアルに入れ、すべてのハエが麻酔から回復するまでバイアルを横に置き、ハエが食べ物にくっつくのを防ぎます。
   3. 細菌感染を導入します。
      1. CO₂の軽い流れの下で必要な数のハエを麻酔します。
      2. 各フライをメディアコントロールと同じ位置に刺し、ピンの先端を手順2.2で準備した細菌懸濁液に浸してから、各フライを刺します。
      3. 刺したハエを新しいハエ用培地を入れた新しいバイアルに入れ、すべてのハエが麻酔から回復するまでバイアルを横に置き、ハエが食べ物にくっつくのを防ぎます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
孵卵器	パワーズサイエンティフィック株式会社	DROS52SD
絵筆
CO2フライパッド	フライスタッフ	59〜114
CO2	エアガス	CD FG50
ショウジョウバエ飼育ミックス
6オンススクエアボトムボトル、ポリプロピレン	ジェネシー・サイエンティフィック	32〜130
Nosterile特大コットンボール	フィッシャーブランド	22-456-882
顕微鏡	オリンパス株式会社	SZ51
ショウジョウバエバイアルポリスチレン	VWRインターナショナル	89092-720
Nosterile大型コットンボール	フィッシャーブランド	22-456-883
2Lフラスコ	VWRインターナショナル	89000から370
透明な蓋付きシャーレ、隆起した隆起した隆起; 100 . x 15 mm;	VWRインターナショナル	25384-302
LB寒天、ミラー	ディフコ	244520
接種ループ	VWRインターナショナル	80094から488
レイニン クラシックピペット さまざまなサイズ 0.1 μl から 2 μl, 2 μl から 20 μl, 20 μl から 200 μl, 100μlから1000	レイニン	PR-2 PR-20 PR-200 PR-1000
マイクロピペットチップ(各種サイズ)	VWRインターナショナル	30128-376 53503-810 16466-008
ルリアブロスベース、ミラー	ディフコ	241420
使い捨て培養チューブホウケイ酸ガラス	VWRインターナショナル	47729から576
S-500 オービタルシェイカー	VWRインターナショナル	14005-830
遠心機	VWRインターナショナル	37001-300
PBSのpH 7.4 10x	インビトゲン	70011044
SmartSpec 3000分光光度計	バイオ・ラッド	〒170-2501
セミマイクロボリュームキュベット	バイオ・ラッド	〒223-9955
鉗子	ファインサイエンスツール	11255から20
ミネラルオイル、ホワイト、ライト	マクロンファインケミカルズ	6358から10
分ピン	ファインサイエンスツール	26002-10
1.5mLマイクロ遠心チューブ;シールライト	USAサイエンティフィック社	1615-5500