大腸菌感染後のショウジョウバエ・メラノガスターにおける大腸菌の細菌負荷の測定

要約

出典: Khalil, S., et al. ショウジョウバエの全身性細菌感染と免疫防御表現型 (2015年)

このビデオでは、Drosophila melanogasterの胸部に大腸菌を注入した後の大腸菌の細菌量を測定する技術を示しています。

プロトコル

1. 感染後の細菌負荷のアッセイ

1. 細菌量を測定します。
   1. 注入後所定の時間に、各フライを氷上の微量遠心チューブに入れます。
   2. 各チューブに250μlのPBSを加え、乳棒またはビーズビーターを使用してハエを均質化します。
   3. ホモジネートをLB寒天プレートにプレート化します(スパイラルプラッターまたは段階希釈液を使用)。
      1. 段階希釈を使用してプレートするには、各フライホモジネートを96ウェルプレートの最初の列に移します。
      2. 残りの各ウェルに90 μlのPBSを充填します。
      3. マルチチャンネルピペットを使用して、フライホモジネートを含む最初の列から10 μlを取り出し、2番目の列に分注します。
      4. ピペットで10回以上上下させて十分に混合した後、10μlを取って3列目に移します。残りの行を使用してこの手順を繰り返します。
      5. 下の列(最も希薄な細菌懸濁液)から始めて、マルチチャンネルピペットを使用して各ウェルから10 μlを取り出し、サンプルが互いに接触しない個別のスポットとして分注されるように注意しながら、LBプレートに沈殿します。各列からすべてのウェルがサンプリングされるまで繰り返し、LBプレート上で希釈の降順で分注します。
      6. スポットがLBプレートに完全に染み込むまで、プレートをRTのままにします.
         手記：使用前にLBプレートをRTで数日間乾燥させることは、液体が容易に吸収されるようにし、サンプルスポット間の偶発的な接触の可能性を最小限に抑えるために推奨されます。
   4. プレートO/Nをインキュベートし、プレートが大きくなりすぎないように注意して、コロニーが小さく離散的なままになるようにします。
      手記：使用する細菌増殖培地とインキュベーション温度によっては、ハエの内因性腸内細菌叢に由来するコロニーが最終的にプレートに現れることがあります。しかし、病原性感染に使用されるほとんどの細菌は、37°CのLB寒天培地の腸内細菌叢よりもはるかに速く増殖します。
   5. 実験細菌が目に見えるコロニーを成長させたとき (通常は 8 〜 12 時間)、ショウジョウバエの腸内細菌叢のコロニーが現れる前 (約 36 時間) に、インキュベーターからプレートを取り出します。増殖の遅い実験細菌の場合は、LB 寒天培地で選択的抗生物質を使用して、腸内細菌叢からコロニーを取り除きます。
   6. 各ホモジネートのコロニー数を数えます。
      1. スパイラルプレートの場合、プレート上のコロニーの数と位置に基づいてホモジネートのmlあたりの細菌量を推定できる自動コロニーカウンターを使用して、成長するコロニーをカウントします。
         注:スパイラルカウントは、細菌濃度が1mlあたり5 x 10²から5 x 10⁴細菌の範囲にある場合に最も正確です。
      2. スポットプレートの場合、30〜300コロニーを含む希釈液から各フライのコロニーを手動でカウントし、元のホモジネートのmlあたりの細菌の数を計算します。
2. データを分析します。
   1. 細菌量が非正規分布の場合は、正規分布により近似するようにデータを変換するか、ノンパラメトリック統計分析(マンホイットニーU検定など)を使用してデータを分析します。Box-Cox 分析を使用して、最適な変換を見つけます。多くの場合、自然対数または基数 -10 の対数変換が効果的です。
   2. データが十分に正規分布しており、対比されている処理が2つしかない場合は、t検定を実行して、2つの処理で平均細菌量が異なるかどうかを判断します。複数の実験変数またはその他の予測因子がある場合は、分散分析(ANOVA)を使用して、細菌負荷の有意な予測因子である因子を判断します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
透明な蓋付きシャーレ、隆起した隆起した隆起; 100 x 15 mm;	VWRインターナショナル	25384-302
LB寒天、ミラー	ディフコ	244520
接種ループ	VWRインターナショナル	80094から488
1.5mLマイクロ遠心チューブ;シールライト	USAサイエンティフィック社	1615-5500
電動乳棒;タルボーイズラボラトリースターラー	トレムナー	103
Talboys ハイスループットホモジナイザー	OPS診断	930145
5/32 ''研削ボール	OPS診断	GBSSの156-5000-01
ボルテックスジーニー	サイエンティフィック・インダストリーズ株式会社	G560
マルチチャンネルピペッター(10uL-300uL)	ザルトリウス	730360
WASP2ホイットリー自動スパイラルプラター	微生物学インターナショナル
ProtoCOL自動コロニーカウンター/プレートカウンター/プレートリーダー	微生物学インターナショナル
孵卵器	パワーズサイエンティフィック株式会社	DROS52SD