培養昆虫細胞におけるショウジョウバエC型ウイルスのウイルス感染量を決定するためのアッセイ

要約

出典:Yang, S. et al., Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster. J. Vis. Exp. (2019)

このビデオでは、ショウジョウバエS2*細胞上のショウジョウバエCウイルスの組織培養感染性ウイルス量を決定するための細胞変性効果アッセイを実演します。培養細胞に感染するために、さまざまなウイルス濃度が使用されます。構造変化を示す細胞の割合が決定され、このデータを使用して組織培養感染量が計算されます。

プロトコル

1. CPEアッセイによるショウジョウバエCウイルス負荷量測定

1. 細胞変性効果(CPE)アッセイ(TCID₅₀の1ユニット= 0.7プラーク形成ユニット[PFU])により、ウイルス組織培養の平均感染用量(TCID₅₀)を決定するために、5つのランダムなウイルス含有チューブを選択します
   手記： CPEとは、ウイルスの侵入によって引き起こされる宿主細胞の構造変化を指します。感染したウイルスは、宿主細胞の溶解を引き起こすか、または細胞が増殖不能のために溶解せずに死滅した場合に起こります。
2. 1日目に、調製したS2*細胞をピペッティングで回収します。セル番号を数えます。細胞を300 x gで4分間遠心分離し、上清を捨てます。細胞を1 x 10⁶細胞/mLの密度に希釈し、S2*細胞用の完全な培地で調製します。
3. ウェルあたり1 x 10⁵ S2*細胞(100 μL)を平底96ウェルプレート(~30%のコンフルエント度)に播種します。
4. S2*細胞用の完全培地でDCVストックの10倍希釈を連続して行います。50 μLの希釈液をウェルに加えます。ウイルスを含まない50μLの培地を、ネガティブコントロールウェルとして分類されたウェルに加えます。
   手記： 各希釈速度について、8ウェルを使用しました。一般的なDCVの収率は約10^{8-10 9} PFU/mLであるため、希釈は少なくとも~10-5-10-10^{をカバーする}必要があります。
5. 4日目は、20倍または40倍の対物レンズを備えた明視野顕微鏡でCPEを観察します。細胞がぼやけて見え、培地が断片でいっぱいのウェルを「ポジティブウェル」として分類し、細胞形態が正常なウェルを「ネガティブウェル」として分類します。
6. CPEのポジティブウェルまたはネガティブウェルをそれぞれ+または-でマークします。ウイルスTCID₅₀をReed and Muench法で計算します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1.5 ml マイクロ遠心チューブ	ブランド	352070
10cm細胞培養皿	シグマ	CLS430167	細胞培養
セルインキュベーター	三洋電機	MIR-553
遠心機	エッペンドルフ	5810R型
遠心機	エッペンドルフ	5424Rの
ショウジョウバエインキュベーター	パーシバル	I-41NL	ショウジョウバエの飼育
FBSの	インビトゲン	12657から029	細胞培養
シュナイダーの昆虫媒体	シグマ	S9895	細胞培養
統計ソフト	GraphPad プリズム 7
平底96ウェルプレート	シグマ	CLS3922	細胞培養
セルインキュベーター	三洋電機	MIR-553
顕微鏡	オリンポス	CKX41

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