動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
1. 骨髄の収穫
- マウスから大腿骨と脛骨を無菌的に除去し、滅菌器具を使用して骨を洗浄します。洗浄した骨をダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)+ 5 mM N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N'-2-エタンスルホン酸(HEPES)+ 0.2 mg/mL L-グルタミン + 0.05 mM 2-メルカプトエタノール + 50 mg/mL 硫酸ゲンタマイシン + 10,000 U/mL ペニシリン/ストレプトマイシン + 10% ウシ胎児血清 (FBS, DMEM-10 完全) に入れ、チューブを氷上で 15 分間インキュベートします。
- はさみを使用して近位と遠位のボールジョイントを取り外します。メディウムを充填した10mLのシリンジに取り付けた25Gの針を骨のくぼみに挿入します。DMEM-10を使用して骨髄を完全に洗い流します。塊がある場合は、培地をピペッティングで優しく上下させて再懸濁します。
- 細胞を300 x gで10分間遠心分離し、血球計算盤を使用して細胞の数をカウントします。この時点で、90% FBS + 10% ジメチルスルホキシド(DMSO)を使用して細胞を凍結するか、15 cm のシャーレで細胞をプレート化し、L929 馴化培地を使用してマクロファージを分化します (ステップ 2.1)。
2. 骨髄由来マクロファージの分化
- 予め加温した分化培地(Swansonらが記載したように、21mLのDMEM-10完全培地および9mLのL929細胞馴染培地)を使用して、骨髄細胞を15cmの非組織培養処理シャーレ(1.2-1.5×107細胞)に入れます。プレートを37°C、5%二酸化炭素、またはCO2で7日間インキュベートします。3日目または4日目に、さらに30 mLの分化培地をプレートに加えます。
手記：組織培養処理したプレートは、マクロファージの剥離や採取が困難になるため、使用しないことが重要です。
- マクロファージを採取するには、プレートをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄し、20 mLの冷たいPBS + 1 mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を加えます。プレートを4°Cで10分間インキュベートします。PBS + EDTAを細胞上にピペッティングし、プレートを10mLのPBSで洗浄することにより、細胞を回収します。両方の洗浄液を2本の15 mLコニカルチューブに混ぜ合わせます。
- 細胞を300 x gで10分間遠心分離し、10 mLのフェノールレッドフリーDMEM + 5 mM HEPES + 0.2 mg / mL L-グルタミン+ 0.05 mM 2-メルカプトエタノール+ 5% FBS(DMEM-5)に再懸濁し、血球計算盤またはコールターカウンターを使用して細胞をカウントします。カウント中は細胞を氷の上に置いてください。
- 組織培養コーティングプレートにマクロファージを2 x 105細胞/mLで播種します。顕微鏡実験では、24ウェルプレートのカバースリップに1 mLの細胞を播種します。乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)放出アッセイでは、96ウェルプレートに100 μLの細胞を播種します。LDHアッセイでは、9ウェル(未処理のウェル3つ、100%溶解コントロールのウェル3つ、実験刺激用のウェル3つ)をシードします。
- 96ウェルプレートを300 x gで5分間遠心分離し、細胞がウェル全体に均等に分布していることを確認します。
- プライミングプロセスを開始する前に、プレートを37°C + 5%CO2で一晩インキュベートします。
3. プライミング
- 培地を、100 ng/mL のリポ多糖または LPS (24 ウェルプレートは 500 μL、96 ウェルプレートは 50 μL) を含む新しい培地 (DMEM-5) と交換します。
手記：LPSにはさまざまな構造的バリエーションがあり、TLR4を介したプライミングを刺激する能力に影響を与えます。Salmonella minnesota R595(Re)のLPSは、複数のベンダーから入手可能であり、推奨されます。
- プレートを37°Cおよび5%CO2で3時間インキュベートします。
4. NLRP3インフラマソームのニゲリシンによる活性化とFAM-YVAD-FMKによる標識
- 培地を取り出し、5 μM ニゲリシンと 5 mM グリシンを含む 290 μL の DMEM-5 と交換します。グリシンは、カスパーゼ-1の活性化中に発生する細胞溶解の量を減らすために添加されます。37°Cおよび5%CO2で60分間インキュベートします。野生型マクロファージとカスパーゼ-1欠損マクロファージの両方を使用して、観察された標識がカスパーゼ-1に特異的であることを確認してください。
- 最後の45分間に、メーカーの指示に従って調製した30x FAM-YVAD-FMKを10 μL追加します。
- 60分後、培地を取り出し、1 mLの冷たいPBSで細胞を5分間ずつ3回洗浄します。
- 250 μLの2%パラホルムアルデヒドを各ウェルに加え、アルミホイルで覆った氷上で30分間インキュベートします。
- 最後の5分間に、0.2 mMの遠赤外蛍光核酸染色液を4 μL加えて核を標識します。4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)または他の色素を使用してDNAを標識することもできます。
- 細胞を1 mLの冷PBSで3回洗浄し、7 μLの退色防止封入剤を使用してカバースリップを顕微鏡スライドにマウントします。埋込み用媒体を一晩硬化させてから、マニキュアを使用してカバースリップを顕微鏡スライドに密封します。
- 共焦点顕微鏡でマクロファージを画像化します。FAM-YVAD-FMK の Ex/Em は 492/520nm、遠赤外蛍光核酸染色は 642/661 です。未処理の細胞が488チャンネルでバックグラウンド染色を示さないように顕微鏡をセットアップしてください。そうしないと、バックグラウンドのFAM-YVAD-FMK染色が検出され、実際の活性カスパーゼ-1は検出されません。
>5. 共焦点顕微鏡による標識マクロファージのイメージング
>注:染色された細胞は、カバーガラスが一晩硬化し、マニキュアで顕微鏡スライドに密封された後に見ることができます。ここでは、共焦点顕微鏡を用いたイメージングについて説明する。細胞は、標準的な蛍光顕微鏡でも観察できます。
- 未処理のコントロール細胞を載せたスライドを顕微鏡ステージに置き、顕微鏡を細胞に焦点を合わせます。
- 顕微鏡のルックアップテーブル(LUT)設定を使用して、未処理の細胞に陽性のFAM-YVAD-FMK染色がないようにオフセットを調整します。このプロセスは、カスパーゼ-1欠損マクロファージを使用しても実行できます.
手記：オフセットは実験で使用するチャンネルごとに調整する必要がありますが、FAM-YVAD-FMK チャンネルと蛍光抗体チャンネルでは、正しいオフセットを設定することが最も重要です。DNAチャネルのオフセットはそれほど重要ではありません。オフセットを設定したら、実験の残りの部分でこの設定を調整しないでください。
- スライドをニゲリシン処理サンプルに切り替えます。FAM-YVAD-FMK 染色の陽性細胞と陰性細胞の両方を含むフィールドを見つけます。FAM-YVAD-FMK チャンネルのイメージング面を、ポジティブ染色の強度が最も高い面に調整します。これは通常、インフラマソームの焦点の中心が画像化される平面です。
- 核が凝縮した細胞に病巣が見えるようにゲインを調整します。ゲインとオフセットの両方を設定した後、残りのイメージングセッションではこれらの設定をそのままにしておきます。
手記：細胞がピロトーシス状態であるかどうかを判断する簡単な方法の1つは、核の形態を調べることです。活性型カスパーゼ-1を有する細胞は、丸みを帯びて凝縮した核を有するが、カスパーゼ-1の活性化がない細胞では核小体が見られ、核形態は未処理の細胞の形態と類似している。
- ランダムに選択された5つのフィールドの画像を合計倍率100倍で収集します。これにより、通常、画像ごとに約 40 個のセルが生成されます。各サンプルについてこのプロセスを繰り返します。
- 画像解析ソフトウェアを使用して、各画像のセル数をカウントします。次に、FAM-YVAD-FMK 染色が陽性の細胞の数をカウントします。カスパーゼ-1の活性化レベルをFAM-YVAD-FMK陽性細胞の割合として表します。
