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動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
1. 骨髄由来マクロファージの分化
- 予め加温した分化培地(Swansonらが記載したように、21mLのDMEM-10完全培地および9mLのL929細胞馴染培地)を使用して、骨髄細胞を15cmの非組織培養処理シャーレ(1.2-1.5×107細胞)に入れます。プレートを37°Cおよび5%CO2で7日間インキュベートします。3日目または4.
日目に、さらに30 mLの分化培地をプレートに加えます。
手記：組織培養処理したプレートは、マクロファージの剥離や採取が困難になるため、使用しないことが重要です。
- マクロファージを採取するには、プレートをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄し、20 mLの冷たいPBS + 1 mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を加えます。プレートを4°Cで10分間インキュベートします。PBS + EDTAを細胞上にピペッティングし、プレートを10mLのPBSで洗浄することにより、細胞を回収します。両方の洗浄液を2本の15 mLコニカルチューブに混ぜ合わせます。
- 細胞を300 x gで10分間遠心分離し、10 mLのフェノールレッドフリーDMEM + 5 mM HEPES + 0.2 mg / mL L-グルタミン+ 0.05 mM 2-メルカプトエタノール+ 5% FBS(DMEM-5)に再懸濁し、血球計算盤またはコールターカウンターを使用して細胞をカウントします。カウント中は細胞を氷の上に置いてください。
- 組織培養コーティングプレートにマクロファージを2 x 105細胞/mLで播種します。顕微鏡実験では、24ウェルプレートのカバースリップに1 mLの細胞を播種します。LDH放出アッセイでは、96ウェルプレートに100 μLの細胞を播種します。LDHアッセイでは、9ウェル(未処理のウェル3つ、100%溶解コントロールのウェル3つ、実験刺激用のウェル3つ)をシードします。
- 96ウェルプレートを300 x gで5分間遠心分離し、細胞がウェル全体に均等に分布していることを確認します。
- プライミングプロセスを開始する前に、プレートを37°C + 5%CO2で一晩インキュベートします。
2. プライミング
- 培地を 100 ng/mL LPS(24 ウェルプレートは 500 μL、96 ウェルプレートは 50 μL)を含む新しい培地(DMEM-5)と交換します。
手記：LPSにはさまざまな構造的バリエーションがあり、TLR4を介したプライミングを刺激する能力に影響を与えます。Salmonella minnesota R595(Re)のLPSは、複数のベンダーから入手可能であり、推奨されます。
- プレートを37°Cおよび5%CO2で3時間インキュベートします。
3. ニゲリシンによるNLRP3インフラマソームの活性化
- 培地を取り出し、5 μM ニゲリシンと 5 mM グリシンを含む 290 μL の DMEM-5 と交換します。グリシンは、カスパーゼ-1の活性化中に発生する細胞溶解の量を減らすために添加されます。37°Cおよび5%CO2で60分間インキュベートします。野生型マクロファージとカスパーゼ-1欠損マクロファージの両方を使用して、観察された標識がカスパーゼ-1に特異的であることを確認してください。
- 60分後、培地を取り出し、1 mLの冷たいPBSで細胞を5分間ずつ3回洗浄します。
4. 抗体染色
>注:ASCを検出するための抗体で細胞を標識するには、前のセクションと同じニゲリシンに細胞を播種し、プライミングし、曝露します。その後の処理は、以下の通りです。
- 細胞を5分間ずつ3回、1mLの冷たいPBSで洗浄します。250 μLの固定および透過化溶液を加えます。細胞を氷上でインキュベートし、30分間蓋をします。
- マクロファージを1mLの洗浄バッファーでそれぞれ5分間、3回洗浄します。
- 1:500に希釈したASCに対する一次抗体250 μLを洗浄バッファーで加え、氷上で1時間インキュベートします。一次抗体を一切受け取らず、二次抗体のみを受け取るカバースリップを1枚含めます。このカバースリップは、顕微鏡のセットアップ中に正しいオフセットを設定するために使用されます。
- 細胞を1 mLの洗浄バッファーで各5分間3回洗浄します。
- 1:500に希釈した二次抗体(蛍光色素標識ヤギ-抗マウス)250 μLを洗浄バッファーで加え、氷上で1時間インキュベートします。このインキュベーションの最後の5分間、0.2 mMの遠赤外蛍光核酸染色剤を4 μL加えて、核を標識します。
- 細胞を1 mLのコールドウォッシュバッファーで3回洗浄し、7 μLの退色防止封入剤を使用してカバースリップを顕微鏡スライドにマウントします。埋込み用メディウムを一晩硬化させてから、透明なマニキュアを使用してカバースリップを顕微鏡スライドに密封します。
- 共焦点顕微鏡によるマクロファージの画像化。二次抗体のEx/Emは555/580 nm、近赤外蛍光核酸染色試薬は642/661です。