ニゲリシン曝露後のマクロファージ死を検出するための乳酸デヒドロゲナーゼ放出アッセイ

要約

出典: den Hartigh, A.B. et al., Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages. J. Vis. Exp. (2018)

このビデオは、インフラマソームを介したマクロファージの死を検出するための乳酸デヒドロゲナーゼアッセイを示しています。マクロファージはプライミングのためにリポ多糖類に曝露され、続いてニゲリシンに曝露されてインフラマソーム誘発性細胞死を引き起こします。これは乳酸デヒドロゲナーゼアッセイによって決定されます。

プロトコル

1. LDH放出アッセイ

>注:LDH放出アッセイでは、96ウェルプレートに細胞を播種します。プライミング後は培地を取り出さないでください。

1. 接着マクロファージ細胞(24ウェルプレートで500μL、96ウェルプレートで50μL)を含むウェルに100 ng/mL LPSを含む新しい培地(DMEM-5:10 mLのフェノールレッドフリーDMEM + 5 mM HEPES + 0.2 mg/mL L-グルタミン + 0.05 mM 2-メルカプトエタノール + 5% FBS)と交換します。
   手記： LPSにはさまざまな構造的バリエーションがあり、TLR4を介したプライミングを刺激する能力に影響を与えます。サルモネラ・ミネソタR595(Re)のLPSをお勧めします。
2. プレートを37°Cおよび5%CO₂で3時間インキュベートします。
3. 10 μMニゲリシンを含むDMEM-5 50 μLを実験ウェルに、DMEM-5 50 μLを自発ウェルおよび100%溶解コントロールウェルに添加します。37°Cおよび5%CO₂で60分間インキュベートします。
4. 30分後、100%溶解コントロールウェルに10 μLの10x Lysis Bufferを添加し、他のウェルに10 μLのDMEM-5を添加します。このインキュベーション中に、フリーザーから1バイアルの基質ミックス(1.5 mLの凍結乾燥基質)と1アリコートのアッセイバッファー(~12 mL)を取り出し、室温まで光から保護して解凍します
   手記： 基質混合物にはテトラゾリウム塩(ヨードニトロテトラゾリウムバイオレット)が含まれており、これを赤色のホルマザン生成物に変換します。
5. 60分間の全インキュベーション後、プレートを500 x g、10°Cで5分間遠心分離し、上清50 μLを透明な平底プレートに移します。この間に、12 mLのアッセイバッファーを基質ミックスのバイアルに加え、室温で5分間インキュベートしてから使用してください。
6. 各ウェルに50 μLの基質を加え、暗所で30分間インキュベートします。空白値用の中程度のみのウェルを含めます。15分後にプレートをチェックして、信号がプレートリーダーの検出限界を超えないことを確認します。
7. 30分後、50 μLの停止溶液(1 M酢酸)を加え、プレートリーダーを使用してOD₄₉₀を測定します。
8. 次の式を使用して、細胞溶解の割合を計算します:
   % 細胞毒性 = ((実験的 - 自然発生)/(最大 - 自然発生))×100
   実験的:ニゲリシン処理細胞;自発的:未処理の細胞;最大:溶解バッファーに曝露された細胞。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Cytotox96 非放射性細胞毒性アッセイ	フィッシャーサイエンティフィック	PR-G1780	基質ミックスとアッセイバッファーが含まれています。独自の処方。停止液は1 M酢酸です
DMEM、高グルコース、グルタミンなし、フェノールレッドなし	インビトゲン	31053028
ダルベッコPBS、カルシウム、マグネシウムなし	インビトゲン	14190144
ウシ胎児血清、認定、米国原産	インビトゲン	26140079	55°Cで50分間不活化
ゲンタマイシン	インビトゲン	15750060
サルモネラ・ミネソタR595(Re)の超高純度LPS	生物製剤のリスト	434
Spectramax M3 プレートリーダー	分子デバイス	5000414
L-グルタミン	インビトゲン	21051024

シリーズ 名