標識済み好中球における好中球細胞外トラップの誘導と可視化

要約

出典:Arends, E. J. et al., 好中球細胞外トラップ形成を評価および定量化するためのハイスループットアッセイ。J. Vis. Exp.(2019年)

このビデオでは、抗好中球細胞質抗体を含む患者血清を使用して、事前に標識された好中球における好中球細胞外トラップまたはNETの誘導と可視化を示しています。さらに、不透過性DNA色素と蛍光顕微鏡を用いることで、NETsの可視化が可能です。

プロトコル

人間の福祉に関する制度的、国内的、国際的なガイドラインに準拠して実施され、地元の施設審査委員会によって審査されています。

1. 健康な好中球の単離

1. 健康なドナーから20 mLの末梢血を、2本の10 mLエチレンジアミン四酢酸(EDTA)コーティングチューブで採取します。
2. 滅菌済みの50mLチューブに10mLの血液を入れ、最大32.5mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を追加します。
3. 細胞の下に密度勾配(Ficoll-amidotrizoaatなど)を追加します。
   1. 10 mLピペットとピペットコントローラーで14 mLの密度グラジエントを採取します。
   2. ピペットを50mLチューブの底に置きます。
   3. ピペットコントローラーをピペットから外し、モーターを使用せずに、キャピラリー効果によって最大に達するまで(1〜2mLが残る)まで、密度勾配が重力によってピペットから流出できるようにします。
   4. ピペットの上に親指を置いてピペットを取り外すと、ピペットの取り外し中に密度勾配が漏れるのを防ぎます。
4. 加速もブレーキもかけずに、912 x g、室温(RT)でチューブを20分間回転させます。
   注:赤血球(RBC)と好中球は高密度で、50mLチューブの底にあります。末梢血単核細胞(PBMC)は分離され、密度勾配の上に白いリングとして乗っています。PBSで希釈された血漿はPBMCの上にあります。必要に応じて、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)による追加の洗浄ステップで、白色リングを新しい50 mLチューブに移すことでPBMCを単離できます。
5. 最初にPBMCを含む白いリングを慎重に除去し、次にPBSで希釈したプラズマを除去し、最後に密度勾配層を可能な限り除去します。
6. 好中球/赤血球混合物から好中球を単離するには、赤血球を冷たい滅菌蒸留水で溶解します。
   1. 冷蔵庫から冷たく滅菌した蒸留水ボトルと10倍濃縮PBSフラスコを取ります。
   2. この手順を迅速に進めます。ペレットの上に36mLの冷たく滅菌蒸留水を直接加え、一度慎重に混ぜます。20秒後に10x PBSを4 mL加えて、等張溶液を作ります。一度慎重に混ぜます。
   3. スピンチューブを739 x g、4°Cで5分間スピンします(赤血球の除去用)。好中球は白いペレットの中にあります。
   4. 上清は慎重に捨てます。手順1.6.2を再度実行し、ペレットが適切に吊り下げられていることを確認します。
   5. チューブを328 x g、4°Cで5分間スピンします。
   6. 上清を慎重に取り除き、ペレットを5mLのPBSに再懸濁します。好中球を数え、氷の上に置いておきます
      注:1本のチューブの血液(10 mL)からの予想収量は、約1,500万〜7,500万の好中球です。.

>2. 好中球の赤色蛍光細胞標識

1. 15mLチューブ内のPBS2mLに1,000万〜2,000万個の好中球懸濁液を作製します。
2. 2 mL PBSと4 μLの2 μM赤色蛍光細胞リンカー(材料表を参照)を別の15 mLチューブに入れた溶液を調製します。これを好中球懸濁液に穏やかに加え、慎重に混合します。
3. 暗所で37°Cで正確に25分間インキュベートし、好中球を赤色蛍光細胞リンカーで標識します。
4. 10%の熱不活化ウシ胎児血清(FBS)を含むロズウェルパークメモリアルインスティテュート(RPMI)1640培地をRTで最大15mLで追加し、1回慎重に混合して、ラベリングを不活性化します。ペレットが形成された場合は、ペレットが慎重に再懸濁されていることを確認してください。
5. 328 x gおよびRTで5分間チューブをスピンします。
6. 上清を取り除き、2% FBS と 10% ペニシリン/ストレプトマイシン (P/S) を含む 5 mL のフェノール赤フリー RPMI 1640 培地にペレットを再懸濁します (RT で< / > 手記： 赤色蛍光細胞の標識後に50%の細胞損失が発生する可能性があります。

>3. 好中球細胞外トラップ形成の誘導

1. 2% FBS と 10% P/S を含む Phenol Red-free RPMI 1640 培地で 0.42 x 10⁶ 細胞/mL の細胞懸濁液を調製します。
2. 37,500 個の好中球をウェルあたり 90 μL で、黒色の 96 ウェルの平底プレートに添加します。
3. 選択した刺激物(例:患者の血清)を10μLをトリプリケートで添加し、ウェル中の濃度が10%になるようにします。常にネガティブコントロール(中)をトリプリケートに含めます。
4. 暗所37°Cで30分から2時間、4時間、または6時間の範囲でインキュベー
トします。
5. ウェル内の最終濃度が 1 μM に達するために、25 μL の 5 μM 不透過性 DNA 色素 (材料表を参照) を 25 μL 添加するために必要な容量を計算します。必要に応じて、2% FBSと10% P/Sを含むRPMI 1640培地で予備希釈を行い、5 μMの濃度を得ます。
6. インキュベーション時間終了の15分前に、5 μM不透過性DNA色素25 μLを添加します。暗所で37°Cでさらに15分間インキュベートを続けます。
7. 上清(~125μL)を非常に慎重に取り除き、必要に応じて保管してください。4%パラホルムアルデヒド(PFA)を100μL加えます。暗闇に置いて、すぐに手順4に進みます。

4. 好中球細胞外トラップ(NET)3Dによる可視化 High-content, High-resolution Immunofluorescence Confocal Microscopy

1. 免疫蛍光共焦点顕微鏡の設定を行うには、Acquisition setupをクリックします。
   1. 「設定」タブをクリックします。
   2. 対物レンズとカメラを選択します。10X Apo Lambda対物レンズは、共焦点60 μmピンホールの取り込みモードを備えています。
   3. プレートをクリックし、96ウェルプラスチックプレートを選択します。アクセスするサイトを選択し、固定数のサイトを選択します。ウェルの合計45%をカバーするオーバーラップ(0μm)なしで3列3
   行を埋めます。
   4. 「Acquisition」をクリックします。[レーザーベースのフォーカシングを有効にする] を選択します。必要に応じて、Z シリーズ/時系列の取得を選択します。
   5. [サイトのオートフォーカス]をクリックします。
      1. 「Focus on Plate Bottom | Off-Set by Bottom Thickness」をクリックします。サンプルを見つけるための最初のウェルには、最初に取得したウェルを選択します。サイトのオートフォーカスには、すべてのサイトを選択します。
   6. [波長]をクリックします。
      1. 波長の数には 2 を選択します。TL シェーディング補正の細分化レベルでは、2 を選択します。
      2. [Wavelength 1] で [Texas Red] を選択します。
         1. オートフォーカスオプションについては、Zオフセットのレーザー、ポストレーザーオフセット1.1μmのレーザーを選択し、200-10のカスタム範囲でZスタックを使用します。
      3. [Wavelength 2] で、[fluorescein isothiocyanate (FITC)] を選択します。
         1. オートフォーカスオプションには、Zオフセットがw1 0 μmのレーザーを選択し、カスタム範囲が200-10のZスタックを使用します。
         2. 取得オプションとして、Zシリーズと2D投影画像の最大値を選択します。取得オプションとして、[シェーディング補正] |オフ。
   7. [Z シリーズ] を選択します。ステップ数を選択します:10。ステップサイズを選択します:3μm(合計範囲は27μmになります)。
2. プレートを免疫蛍光共焦点顕微鏡にセットします。
   1. 「実行」タブをクリックします。
      1. プレートの名前と説明を入力し、保管場所を選択します。
      2. 取得する必要のあるウェルを選択します。
3. Texas RedとFITCの露光時間を選択します。
4. Acquire Plateをクリックして取得を開始し、プレートあたり約1時間かかります。

>5. NETフォーメーションの解析

1. 科学的な多次元画像の解析用に設計された画像処理プログラム(「資料の表」を参照)を使用して、NET形成を解析します。
2. 取得した画像データを別のハードディスクに転送します。
3. 色追加ツールを選択します。
   1. w1を選択し、データが保存されているハードドライブ内のフォルダを選択します。
   2. w2 を選択し、データが保存されているハード ドライブ内のフォルダを選択します。
      手記： ファイル名に w1 を使用して Texas Red イメージに赤色を追加し、w2 を使用して FITC イメージに緑色を追加する標準マクロを使用します。
4. [分析マクロ] を選択します。
   1. w1 を選択し、しきい値 (強度しきい値) (通常は 10) を選択します。目的のピクセル値(サイズのしきい値、100など)を選択します。
   2. [w2] を選択し、しきい値 (強度しきい値) (通常は 10) を選択します。目的のピクセル値(サイズのしきい値、500など)を選択します。
   3. スプレッドシート ファイルの保存先を選択し、解析を実行して、後でログ ファイルを保存します。
5. スプレッドシートでデータを分析します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アクア滅菌H2O	B.ブラウン、メルズンゲン、ドイツ	12604052
ウシ胎児血清(FBS)	Bodinco、アルクマール、オランダ		高濃度で使用すると、NET形成を不透明にする可能性があります
Ficoll 5,7% - amidotrizoaat 9% 密度 1,077 g / mL	LUMC、ライデン、オランダ	97902861
免疫蛍光共焦点顕微鏡	Image Xpress Micro Confocal (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)
中和PBS(10x)	Gibco、ペイズリー、英国	〒70011-036
ペニシリン/ストレプトマイシン(p / s)	Gibco、ペイズリー、英国	15070063
フェノールレッドフリーRPMI 1640(1x)	Gibco、ペイズリー、英国	11835-063	フェノールレッドは免疫蛍光シグナルを妨害する可能性があります
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)	B.ブラウン、メルズンゲン、ドイツ	174628062
PKH26 2 uM 赤色蛍光細胞リンカー	シグマ・アルドリッチ・サンルイ、ミズーリ州、アメリカ	PKH26GL-1KT	PKHは、特許取得済みの蛍光色素であり、発見者Paul Karl Horanにちなんで名付けられた細胞標識技術
科学的な多次元画像解析プログラム	ImageJ、国立精神衛生研究所研究サービス部門、ベセスダ、メリーランド州、米国
RPMI ミディアム 1640 (1x)	Gibco、ペイズリー、英国	〒52400-025
Sytox green 5 mM 不透過性 DNA 色素	Gibco、ペイズリー、英国	57020
トリパンブルーステイン0,4%	Sigma Aldrich(ドイツ)	17942E
96ウェル、黒、平底、組織培養処理プレート	ファルコン、ニューヨーク、アメリカ	353219