二相性分離によるヒト血液由来好中球からの脂質の単離

要約

出典:Brogden, G., et al.好中球の脂質変化とそれに続く好中球細胞外トラップの形成を研究する方法。 J. Vis. Exp.(2017年)

このビデオは、メタノールとクロロホルムを使用した二相性溶媒システムによるヒト好中球からの脂質分離を示しています。

プロトコル

1. ヒト血液由来好中球の脂質分離と解析

1. 好中球を採取し、氷の上に置きます。
2. 氷上で、好中球(メタノールとクロロホルム溶液中に存在する)をポリテトラフルオロエチレン(PTFE)シール付きの15 mLスクリューキャップガラス管にピペットで移し、1分間振とうして均質化します。ゴム/プラスチックによる汚染を防ぐためにPTFEキャップを使用してください。
3. 2 mLのメタノールを加え、続いて1分後に1 mLのクロロホルムを加えます。もう一度1分間振とうします。
4. ガラス管をRTと50rpmで30分間回転させます。
5. 溶液を7°Cおよび1,952 x gで10分間遠心分離することにより、タンパク質画分をペレット
化します。
6. 上清を新しい15 mLガラス製スクリューキャップチューブに慎重にデカントし、タンパク質含有ペレットを残します。ペレットは、将来の定量のために-20°Cで保存します。
7. クロロホルム 1 mL を加え、1 分間待ってから 1 mL の再蒸留水を加え、ガラス製スクリューキャップチューブをサンプルと反転させて 30 秒間加熱します。
8. 7°C、1,952 x gで10分間遠心分離し、上相を曇り層まで廃棄します(ただし、濁った層は含まれません)。
9. 必要に応じて、ステップ1.1.8を繰り返して....

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
10 μl シリンジ	ハミルトン	701 NR 10 μl
カニューレ 26G	ブラウン	4657683
クロロホルム	カール・ロス	7331.1
メタノール	カール・ロス	7342.1
水	カール・ロス	3255.1	エンドトキシンフリー