マクロファージにおけるCryptococcus neoformans感染を検出するための乳酸デヒドロゲナーゼ放出アッセイ

要約

出典: Ball, B., et al. Label-Free Quantitative Proteomics Workflow for Discovery-Driven Host-Pathogen Interactions. J. Vis. Exp.(2020年)

このビデオでは、マクロファージにおける病原菌であるCryptococcus neoformansの感染を評価するための細胞毒性アッセイを実演しています。細胞毒性は、クリプトコッカス・ネオフォルマンス感染によるマクロファージ溶解による細胞質乳酸デヒドロゲナーゼ酵素の放出によって決定されます。

プロトコル

1. 感染の確認

>注:細胞毒性アッセイを使用して、感染能力を測定することができます。次のプロトコルでは、LDH(乳酸デヒドロゲナーゼ)の放出を測定するための細胞毒性製品の応用を強調します。他の細胞毒性製品も使用できます

1. マクロファージ細胞のC.neoformans感染の調製
   1. 真菌細胞の調製
      1. グリセロールストックを使用して、野生型C.neoformans株(H99)を酵母抽出物ペプトンデキストロース(YPD)寒天プレートにストリークし、単一コロニーを分離します。
      2. 静置型インキュベーターで37°Cで16時間一晩インキュベートします。
      3. 野生型C. neoformans株の1コロニーを選択し、ゆるくキャップされた10 mL試験管内の5 mLのYPDブロスで培養します。4 倍で実行します。
      4. 200 rpmの振とうインキュベーターで37°C、16時間一晩インキュベートします。
      5. 翌日、各一晩で1:100の希釈液で3mLのYPDブロスに継代培養します。
      6. 真菌培養物の光学密度(OD_600nm)値を測定して、中間対数相を決定します。分光光度計にもよりますが、C. neoformans野生型株は、一般的にYPDで6〜8時間のインキュベーション後、1.0〜1.5の範囲の一般的な_OD600nm値で中対数期に達します。
      7. 細胞が中対数期に達したら、真菌細胞懸濁液の10 μLアリコートを清潔な1.5 mL微量遠心チューブに取り、滅菌済みの1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で1:100を希釈します。血球計算盤を使用して細胞の数を数えます。
      8. 細胞を1,500 x gで10分間回収して遠心分離し、ペレットを滅菌室温PBSで穏やかに洗浄し、合計3回の洗浄を繰り返します。
      9. 抗生物質を含まない細胞培養液に細胞を再懸濁して、1.2 x 10⁸細胞/mLの濃度を達成します。
   2. マクロファージ細胞の調製
      1. 6ウェルプレートの各ウェルを視覚化して、細胞が70〜80%のコンフルエントに達したことを確認します。あるいは、細胞を測定して、ウェルあたり約1.2 x 10⁶個のマクロファージ細胞を達成することもできます。
      2. 細胞培養作業の前に、抗生物質を添加した培地を37°Cまで温めます。細胞培養作業の前に、作業環境が滅菌されていることを確認してください。光学顕微鏡を使用して細胞を視覚化し、細胞が接着して健康であることを確認します。
      3. 細胞培養培地をセディッシュから取り出し、血清学的ピペットまたは真空吸引器を使用します。
      4. 5〜7mLの滅菌室温PBS(リン酸緩衝生理食塩水)を60 x 15 mmのディッシュに穏やかに加えます。
      5. 皿をそっと傾けて、付着した細胞を洗います。
   3. C. neoformansとマクロファージ細胞の共培養
      1. 再懸濁したC. neoformans細胞1 mLをマクロファージ細胞を含む4つのウェルに加えます
         手記： 実験を開始する前に、必要なプレート数を計算する必要があります。1 mLの抗生物質を含まない培地を空のウェルに加えます。
      2. 細胞を5%_CO2で37°Cで3時間インキュベートします。
      3. 細胞培養培地を血清学的ピペットまたは真空吸引器のいずれかでプレートから取り出します。
      4. 滅菌室温PBS1mLを静かに加えます。
      5. プレートを静かに傾けて、付着していない、または食作用のない細胞外細胞C.neoformans細胞を洗浄します。
      6. 1 mLの抗生物質を含まない培地を6ウェルプレートの各ウェルに加えます。
      7. 細胞を37°Cで5%_CO2とインキュベートします。
   4. 選択した時点(例:.、1、3、6、12、および24時間)で、製造元の指示に従ってLDH放出を測定するために上清を収集します。
   5. 同時に、感染していないマクロファージ細胞は、最大の細胞毒性を得るために決定された値に溶解されます。
   6. 細胞毒性を次のように計算します:
      

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
100 mM Tris-HCl、pH 8.5	フィッシャーサイエンティフィック	BP152-1	4°Cで維持します
60 x 15 mm ディッシュ、Nunclon Delta	サーモフィッシャーサイエンティフィック	174888
6ウェル細胞培養プレート	サーモフィッシャーサイエンティフィック	140675
コニカルファルコンチューブ(15 mL)	フィッシャーサイエンティフィック	05-539-12
Countess II 自動セルカウンター	サーモフィッシャーサイエンティフィック	AMQAX1000	必須ではありませんが、血球計算盤は代わりに使用できます。
CytoTox 96 非放射性細胞毒性アッセイ	プロメガ	G1780
DMEM、高グルコース、GlutaMAXサプリメント	サーモフィッシャーサイエンティフィック	10566016
ウシ胎児血清(FBS)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	12483020	60°Cで30分間インキュベートすることにより、熱不活化します。50mlのアリコートを準備し、急速冷凍します。培地調製前の解凍
血球計算盤	VWRの	15170-208
ヘープス	シグマ・アルドリッチ	H3375-J	40 mM HEPES/8 M尿素をバルクストック溶液に調製し、瞬間凍結し、使用するまで-20°Cで保存します。使用後は毎回廃棄してください(凍結融解を繰り返し行わないでください)。
L-グルタミン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	25030081	アリコートして冷凍して保存することができます。培地調製の前に解凍します。
マイクロ遠心分離機	エッペンドルフ	13864457
ペニシリン:ストレプトマイシン10k / 10k	VWRの	CA12001-692	アリコートして冷凍して保存することができます。培地調製の前に解凍します。
リン酸緩衝生理食塩水	VWRの	CA12001-676	購入は不要です。PBSも調製できますが、使用前に滅菌ろ過を行う必要があります。
ピペット、使い捨て血清学(10 mL)	フィッシャーサイエンティフィック	13-678-11E
ピペット、ディスポーザブル血清学的(25 mL)バシックス	フィッシャーサイエンティフィック	14955235
トリプシン/Lys-Cプロテアーゼミックス、MSグレード	刺す	A40007	-20°Cに維持します。
尿素	シグマ・アルドリッチ	U1250-1KG	40 mM HEPES/8 M尿素をバルクストック溶液に調製し、急速冷凍し、使用するまで-20°Cで保存します。使用後は毎回廃棄してください(凍結融解を繰り返し行わないでください)。
酵母抽出物ペプトンデキストロースブロス	BDディフコ	BM20