細菌毒素の影響を研究するための透過性膜インサートベースの感染システム

Abstract

出典:Flaherty, R. A., et al.分泌された細菌毒素が哺乳類の宿主細胞に及ぼす影響を研究するための透過性膜インサートベースの感染システムの実装。J. Vis. Exp.(2016年)。

このビデオは、分泌された細菌毒素の影響を評価するための透過性メンブレンインサートベースの感染システムを示しています。この技術は、透過性膜を使用して細菌性病原体と宿主細胞との間の直接接触を排除することにより、病原性細菌が分泌する毒素が哺乳類の宿主細胞に及ぼす影響を研究することを可能にします。

Protocol

1. 細菌培養

1. 目的の特定の分泌因子の研究に使用する同質遺伝子変異株を生成します.
   手記：これらの実験に利用されたGAS(グループA連鎖球菌)M1T1 5448株には、WT(野生型)GAS'、sagAΔ猫SLS欠損(sag=ストレプトリジンS関連遺伝子、SLS=ストレプトリシンS)変異体(本文中ではΔsagAと略される)、およびsagA補体株(本文中ではΔsagA+sagAと略される)が含まれていた。
2. 目的の細菌株の液体培養液を一晩調製します。ヒト細胞に感染する前に、10 mLのTodd-HewittブロスでGAS M1T1 5448株を37°Cで16〜20時間増殖させます。
3. 細菌培養物(2,400 rcf、10分間)を一晩遠心分離し、新鮮な細菌培地に再懸濁します
   手記：一晩培養したのと同じ容量(5〜10ml)での再懸濁は、一般に望ましい初期光学密度を生じる。
4. 再懸濁した培養物を追加の細菌培地で希釈することにより、再懸濁した培養物を追加の細菌培地で希釈することにより、試験するすべての菌株で同じ光学密度が得られるまで、細菌培養物を等しい開始濃度に標準化します(便宜上、約1.0の_OD600を推奨します)
   手記：これらの研究では、固定期の細菌培養物を使用して、正常化直後に宿主細胞に感染させました。しかし、細菌の一部の菌株は非同期的に固定相から出るため、目的の菌株に当てはまることがわかった場合は、対数期培養で宿主感染を開始する方が適切かもしれません。
5. さらなる分析を行う前に、コロニーカウンティングアッセイを実施して、開始培養物中に存在するミリリットルあたりのコロニー形成単位(CFU)を決定し、感染の多様性(MOI)、または宿主細胞あたりの細菌の比率を決定できるようにします。
   1. リン酸緩衝生理食塩水(PBS)または適切な細菌増殖培地(これらの研究ではTodd-Hewittブロスを使用)で所望の光学密度に正規化された細菌培養物の1 mLの段階希釈液を調製します。^10-1から^10-6の範囲の希釈液を調製して、可算コロニー(30-300コロニー)を持つ寒天プレートの少なくとも1セットを生成します。すべての希釈を三回に分けて行います。
   2. 各段階希釈液100 μlを、分析対象の細菌種に適した培地が入った寒天プレートに移します。
      手記：これらの研究では、トッド・ヒューイット寒天培地を使用しました。
   3. ガラス製またはプラスチック製のバクテリアスプレッダーを使用して、100 μlのアリコートを寒天プレートの全面に均等に分散させ、液体が寒天に吸収されるまで広げ続けます。無菌技術を使用して炎の下で実行します。
   4. 寒天プレートを37°Cで一晩、または可算コロニーが現れるまでインキュベー
   トします。
   5. 各プレートで増殖するコロニーを数え、次の式で元の培養物のCFU/mlを計算します:コロニー数xミリリットルでメッキされた連続希釈/培養量の逆数.
      例:(200コロニー×1/^10-5希釈)/0.1mlメッキ=2.0×10^8CFU/ml。

2. 宿主細胞の培養

1. 目的の分析に適した宿主細胞株を入手してください
   手記：これらの研究には、V. Nizetからの親切な贈り物であるHaCaTヒト上皮ケラチノサイトが使用されました。
   1. 100 mmの培養皿にHaCaT細胞を100 mm培養皿に保持し、10%熱不活化ウシ胎児血清(FBS)を添加したダルベッコのModified Eagle's Medium(DMEM)で保存します。37°Cで5%_CO2とインキュベー
   トします。

3. 透過性メンブレンインサートシステムによる宿主細胞感染

1. 適切な組織培養皿で細胞をプレート化し、90%のコンフルエンシーに達するまで成長させます.
   手記：これらの研究で使用されたHaCaT細胞は、通常、めっき後2〜3日以内にコンフルエントに達します。
   1. ライセートの収集(シグナル伝達分析やアデノシン三リン酸(ATP)測定アッセイなど)では、HaCaT細胞を6ウェルディッシュに播種密度約3 x 10⁵細胞/ウェルでプレート
   化します。
   2. 免疫蛍光イメージング実験では、滅菌ガラスカバースリップ上のプレート細胞を、約3 x 10⁵細胞/ウェルの播種密度で6ウェル皿内に
   配置します。
   3. エチジウムホモダイマー膜透過化および乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)放出アッセイでは、HaCaT細胞を24ウェルディッシュに播種密度約5 x 10⁴細胞/ウェルでプレート化します。
2. 処理の直前に、1x滅菌PBSで細胞を洗浄します。
3. 新鮮な増殖培地を細胞に塗布します。ここで説明する条件では、6ウェルプレートの場合はウェルあたり2 mLの培地を、24ウェルプレートの場合はウェルあたり0.5 mLの培地を適用します。薬理学的治療がテストされている場合は、新鮮な培地と混合し、このステップで適用します.
   注:アッセイによっては、代替培地が必要な場合があります。例えば、フェノールレッドと高血清濃度がLDH放出アッセイに干渉するため、フェノールレッドを含まないダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)に1%ウシ血清アルブミン(BSA)(w/v)、2 mM L-グルタミン、および1 mMピルビン酸ナトリウムを添加した実験を行いました。
4. 新鮮な培地を塗布した後、滅菌済みの0.4 μm透過性メンブレンインサートを各ウェルに慎重に配置します。このステップを層流フードで行い、滅菌鉗子を使用して透過性メンブレンインサートを各ウェルに移します。
5. メーカーの指示に従って、新鮮な細胞培養培地を各ウェルの上部チャンバーに塗布します。ここで説明する条件では、6ウェルプレートの場合はウェルあたり1 mLの培地を、24ウェルプレートの場合はウェルあたり0.1 mLの培地を適用します。
6. 適切な量の正規化された細菌培養物(セクション1を参照)を透過性メンブレンインサートシステムの上部チャンバーに適用します。感染していないコントロール治療には、細菌培地を使用してください。ここで説明する結果を得るには、24ウェルプレートの場合はチャンバーあたり25 μlの正規化培養物を、6ウェルプレートの場合はチャンバーあたり100 μlの培養物を追加します
   注:これらの研究では、野生型または変異型のGASをMOI10で宿主細胞に適用しました。MOIは、最終的な真核細胞数(例:2 x 10⁶細胞/ウェル)に基づいて計算され、感染期間の開始時に宿主細胞あたり10倍の細菌が添加されました(例:ウェルあたり2 x 10⁷ CFU)。適切なMOIは、細菌種や必要なフォローアップ分析によって異なります
   手記：非感染コントロールに細菌培地を使用することに加えて、この手法の特定のアプリケーションのための他の有用なコントロールには、比較のために熱殺された細菌または使用済み細菌培地が含まれる場合があります。
7. 感染細胞を37°Cで5%CO₂とインキュベートします。

4. サンプルコレクション

1. フォローアップ分析のために細胞培養培地、宿主細胞溶解物、または無傷の細胞を含むガラスカバースリップを回収するには、まず滅菌鉗子で透過性メンブレンインサートを慎重に除去します。
2. 分泌宿主タンパク質の評価:
   1. 下部チャンバーから培地を1.5mlチューブに集めます。収集中に単層を乱さないでください。
   2. 14,000 rcfで4°Cで10分間サンプルを遠心分離し、細胞の破片を除去します。
   3. 上清50μlを除くすべての上清を新しい1.5 mLチューブに移し、-20°Cで保存するか、すぐに使用してください。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
トッド・ヒューイット・ブロス	アキュメディア	7161A型	目的の細菌種に適したブロスを使用してください。
バイオスペクトロメーター	エッペンドルフ	基本モデル	任意のUV-Vis分光光度計が適しています。
ペトリ皿	フィッシャーサイエンティフィック	FB0875713	他のブランドが適しています。
寒天	シグマ	A1296-1キロ	他のブランドが適しています。
HaCaTヒト上皮ケラチノサイト			ビクター・ニゼットの研究室からの贈り物。
ダルベッコのモディファイドイーグルズミディアム(DMEM)	ライフテクノロジー	11995年073	目的の細胞株に適した培地を使用してください。
ウシ胎児血清(FBS)	バイオウエスト	S162Hシリーズ	目的の細胞株に適した培地添加剤を使用してください。
10cmティッシュカルチャーディッシュ	ヌンク	150350	他のブランドが適しています。
6ウェル組織培養皿	サイトワン	CC7682-7506	他のブランドも適していますが、コーニングインサートと互換性がある必要があります。
24ウェル組織培養皿	サイトワン	CC7682-7524	他のブランドも適していますが、コーニングインサートと互換性がある必要があります。
ガラスカバースリップ	フィッシャーブランド	12-541-B	これらは、セルプレーティングに使用する前にオートクレーブ滅菌する必要があります。
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)	ギブコ	〒10010-023
フェノールレッドフリーDMEM	ライフテクノロジー	31053028	Phenol Red-Free培地は、LDHリリースアッセイにのみ必要です。
ウシ血清アルブミン(BSA)	フィッシャーサイエンティフィック	BP1600-100
L-グルタミン	ギブコ	25030149	LDH放出アッセイ用の細胞培養培地を補充する場合にのみ必要です。
ピルビン酸ナトリウム	ギブコ	BP356100	LDH放出アッセイ用の細胞培養培地を補充する場合にのみ必要です。
コラーゲンコーティングされた0.4μmトランズウェルインサート(6ウェル)	コーニング	3540
コラーゲンコーティングされた0.4μmトランズウェルインサート(24ウェル)	コーニング	3595
鉗子	漁夫	3120018	これらは、Transwellインサートをハンドリングする前にエタノールで滅菌する必要があります。
セルスクレーパー	フィッシャーブランド	08-100-241	これらは、細胞ライセートの収集にのみ必要です。