透過性膜システムで培養した感染した宿主細胞からの宿主細胞ライセートの抽出

要約

出典:Flaherty, R. A., et al. Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells. J. Vis. Exp. (2016).

このビデオは、制御された分離された方法で宿主細胞に対する細菌毒素の影響を調査するための透過性膜挿入システムを示しています。このアプローチにより、細胞を毒素に選択的に曝露しながら、自然の宿主と病原体の相互作用を模倣した物理的分離を維持することができます。

プロトコル

1. 細菌培養

1. 目的の特定の分泌因子の研究に使用する同質遺伝子変異株を生成します.
   手記：これらの実験に利用されたGASM1T1 5448連鎖球菌株には、WT GAS'、sagAΔcat SLS欠損変異体(本文中ではΔsagAと略記)、およびsagA補体株(本文中ではΔsagA+sagAと略記)が含まれていました。
2. ヒト細胞に感染する前に、-10 mLのTodd-Hewittブロスで37°Cの16〜20時間、GAS M1T1 5448
株を培養します。
3. 細菌培養物(2,400 rcf、10分間)を一晩遠心分離し、新鮮な細菌培地に再懸濁します
   手記：一晩培養したのと同じ容量(5〜10ml)での再懸濁は、一般に望ましい初期光学密度を生じる。
4. 再懸濁した培養物を追加の細菌培地で希釈することにより、再懸濁した培養物を600 nm(OD600)で同じ光学密度が得られるまで、試験するすべての菌株(便宜上、約1.0のOD600を推奨)で細菌培養物を等しい開始濃度に正規化します。
   手記：これらの研究では、固定期の細菌培養物を使用して、正常化直後に宿主細胞に感染させました。しかし、細菌の一部の菌株は非同期的に固定相から出るため、目的の菌株に当てはまることがわかった場合は、対数期培養で宿主感染を開始する方が適切かもしれません。
5. さらなる分析を行う前に、コロニーカウンティングアッセイを実施して、開始培養物中に存在するミリリットルあたりのコロニー形成単位(CFU)を決定し、感染の多様性(MOI)、または宿主細胞あたりの細菌の比率を決定できるようにします。
   1. リン酸緩衝生理食塩水(PBS)または適切な細菌増殖培地(これらの研究ではTodd-Hewittブロスを使用)で所望の光学密度に正規化された細菌培養物の1 mLの段階希釈液を調製します。^10-1から10-6の範囲の希釈液を調製して、可算コロニー(30-300コロニー)を持つ寒天プレートの少なくとも1セットを生成します。すべての希釈を三回に分けて行います。
   2. 各段階希釈液100 μlを、分析対象の細菌種に適した培地が入った寒天プレートに移します。
      手記：これらの研究では、トッド・ヒューイット寒天培地を使用しました。
   3. ガラス製またはプラスチック製のバクテリアスプレッダーを使用して、100 μlのアリコートを寒天プレートの全面に均等に分散させ、液体が寒天に吸収されるまで広げ続けます。無菌技術を使用して炎の下で実行します。
   4. 寒天プレートを37°Cで一晩、または可算コロニーが現れるまでインキュベートします。
   5. 各プレートで増殖するコロニーを数え、次の式で元の培養物のCFU/mlを計算します:コロニー数xミリリットルでメッキされた連続希釈/培養量の逆数.
      例:(200コロニー×1/^10-5希釈)/0.1mlメッキ=2.0×10^8CFU/ml

2. 宿主細胞の培養

1. 目的の分析に適した宿主細胞株を入手してください
   手記：これらの研究には、V. Nizetからの親切な贈り物であるHaCaTヒト上皮ケラチノサイト29が使用された。
   1. 100 mmの培養皿にHaCaT細胞を100 mm培養皿に保持し、10%熱不活化ウシ胎児血清(FBS)を添加したダルベッコのModified Eagle's Medium(DMEM)で保存します。37°Cで5% CO₂とインキュベートします。

3. 透過性メンブレンインサートシステムによる宿主細胞感染

1. 適切な組織培養皿で細胞をプレート化し、90%のコンフルエンシーに達するまで成長させます.
   注:これらの研究で使用されたHaCaT細胞は、通常、プレーティング後2〜3日以内にコンフルエントに達します。
   1. ライセートの収集(シグナル伝達分析やアデノシン三リン酸(ATP)測定アッセイなど)では、HaCaT細胞を6ウェルディッシュに播種密度約3 x 10⁵細胞/ウェルでプレート
   化します。
   2. 免疫蛍光イメージング実験では、滅菌ガラスカバースリップ上のプレート細胞を、約3 x 10⁵細胞/ウェルの播種密度で6ウェル皿内に
   配置します。
   3. エチジウムホモダイマー膜透過化および乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)放出アッセイでは、HaCaT細胞を24ウェルディッシュに播種密度約5 x 10⁴細胞/ウェルでプレート化します。
2. 処理の直前に、1x滅菌PBSで細胞を洗浄します。
3. 新鮮な増殖培地を細胞に塗布します。ここで説明する条件では、6ウェルプレートの場合はウェルあたり2 mLの培地を、24ウェルプレートの場合はウェルあたり0.5 mLの培地を適用します。薬理学的治療がテストされている場合は、新鮮な培地と混合し、このステップで適用します.
   手記： アッセイによっては、代替培地が必要な場合があります。例えば、フェノールレッドと高血清濃度がLDH放出アッセイに干渉するため、これらの実験には、1%ウシ血清アルブミン(BSA)(w/v)、2 mM L-グルタミン、および1 mMピルビン酸ナトリウムを添加したフェノールレッドフリーDMEMを利用しました。
4. 新鮮な培地を塗布した後、滅菌済みの0.4 μm透過性メンブレンインサートを各ウェルに慎重に配置します。このステップを層流フードで行い、滅菌鉗子を使用して透過性メンブレンインサートを各ウェルに移します。
5. メーカーの指示に従って、新鮮な細胞培養培地を各ウェルの上部チャンバーに塗布します。ここで説明する条件では、6ウェルプレートの場合はウェルあたり1 mLの培地を、24ウェルプレートの場合はウェルあたり0.1 mLの培地を適用します。
6. 適切な量の正規化された細菌培養物(セクション1を参照)を透過性メンブレンインサートシステムの上部チャンバーに適用します。感染していないコントロール治療には、細菌培地を使用してください。ここで説明する結果を得るには、24ウェルプレートの場合はチャンバーあたり25 μlの正規化培養物を、6ウェルプレートの場合はチャンバーあたり100 μlの培養物を追加します
   注:これらの研究では、野生型または変異型のGASをMOI10で宿主細胞に適用しました。MOIは、最終的な真核細胞数(例:2 x 10⁶細胞/ウェル)に基づいて計算され、感染期間の開始時に宿主細胞あたり10倍の細菌が添加されました(例:ウェルあたり2 x 10⁷ CFU)。適切なMOIは、細菌種や必要なフォローアップ分析によって異なります
   注:感染していないコントロールに細菌培地を使用することに加えて、この手法の特定のアプリケーションのための他の有用なコントロールには、比較のために加熱死菌または使用済み細菌培地が含まれる場合があります。
7. 感染細胞を37°Cで5%CO₂とインキュベートします。

4. サンプルコレクション

1. フォローアップ分析のために細胞培養培地、宿主細胞溶解物、または無傷の細胞を含むガラスカバースリップを回収するには、まず滅菌鉗子で透過性メンブレンインサートを慎重に除去します。
2. 宿主細胞ライセートの評価について:
   1. 宿主細胞の単層の上の培地を穏やかに吸引します。単層を乱すとサンプルが失われる可能性があるため、避けてください。
   2. 細胞を1x PBSで一度すすぎます。
   3. PBSをやさしく吸引します。直ちに適切な量の氷冷溶解バッファーを塗布して目的のタンパク質濃度を達成し、サンプルを氷上で15分間インキュベートします。各6ウェルプレートのウェルあたり200 μlから350 μlの溶解バッファーを塗布して、タンパク質濃度が0.5 - 1.5 mg/mlになるように
      注:これらの試験で使用した溶解バッファーは、脱イオン水、1%(v/v)Nonidet P40 Substitute、ホスファターゼ阻害剤カクテル、およびプロテアーゼ阻害剤カクテルで構成されていました。特定の試薬は、材料および機器のセクションに記載されています。
   4. セルスクレーパーを使用して各ウェルのプレート表面から細胞を剥がし、各ウェルの内容物全体を1.5 mLチューブにピペットで移します。
   5. 14,000 rcfで4°Cで20分間サンプルを遠心分離します。
   6. 可溶性ライセート成分を評価するには、上清を新しいチューブに移し、-20°Cで保存するか、すぐに使用してください。
   7. 核組成またはその他の不溶性ライセート成分を評価するには、ペレットを保管して-20°Cで保管するか、すぐに使用してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
HaCaTヒト上皮ケラチノサイト			ビクター・ニゼットの研究室からの贈り物。
ダルベッコのモディファイドイーグルズミディアム(DMEM)	ライフテクノロジー	11995年073	目的の細胞株に適した培地を使用してください。
ウシ胎児血清(FBS)	バイオウエスト	S162Hシリーズ	目的の細胞株に適した培地添加剤を使用してください。
10cmティッシュカルチャーディッシュ	ヌンク	150350	他のブランドが適しています。
6ウェル組織培養皿	サイトワン	CC7682-7506	他のブランドも適していますが、コーニングインサートと互換性がある必要があります。
コラーゲンコーティングされた0.4μmトランズウェルインサート(6ウェル)	コーニング	3540
コラーゲンコーティングされた0.4μmトランズウェルインサート(24ウェル)	コーニング	3595
セルスクレーパー	フィッシャーブランド	08-100-241	これらは、細胞ライセートの収集にのみ必要です。
ノニデットP40代替品	シグマ	74385から1L	他のサプライヤーが適しています。

月 名 名 (代表)