方法論記事

蛍光イメージングによる宿主細胞への細菌付着の検出

2025年7月8日

この記事について

要約

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出典:Yang, J., et al.宿主細胞への細菌付着の自動ハイスループット検出。J. Vis. Exp.(2021年)

このビデオでは、蛍光顕微鏡ベースのイメージングを使用して宿主と病原体の相互作用のダイナミクスを研究するために、GFPタグ付き細菌の上皮細胞培養への細菌付着アッセイを示しています。

プロトコル

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1. 細菌の付着と宿主細胞の染色

  1. まず、播種したA549細胞単層を温かい1x PBSで3回洗浄します。各洗浄ごとに、1x PBSを各ウェルに100 μLを加え、ピペットで3回静かに上下させ、1x PBSを廃棄するか、添加後10秒待ってから、真空で1x PBSを除去します。細菌の会合の動態を決定するには、異なるMOI(0、1、10、および100)の所望濃度の細菌懸濁液100μLを細胞に重ね合わせます。細菌を200 x gで10分間スピンダウンし、感染したA549細胞を37°C、5%CO2でさらに1時間インキュベートします
    手記： この実験では、各条件に技術的な三重がありました。
  2. 上記のように、単層を温かい1x PBSで5回洗浄することにより、結合していない細菌を取り除きます。100 μLの4%ホルムアルデヒド(1x PBS中)を96ウェルプレートの各ウェルに加え、細胞を固定します。プレートを氷上に15分間置いてから、1x PBSを使用して固定溶液を3回洗い流します。
  3. 核を染色するには、50 ng/mLの4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)を加え、室温で10分間インキュベートします。インキュベーション後、1x PBSを使用してウェルを3回洗浄します。感染したA549細胞を1x PBS100μLで覆い、乾燥を防ぎます。次のステップに進むか、プレートを4°Cで最大2日間暗所で保管します。

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開示事項

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利益相反は宣言されていません。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
10倍PBSVWRの45001-130
4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール (DAPI)サーモフィッシャー62248宿主細胞染色色素
96ウェルプレートコーニング3882半分の面積がよく、底が平らでクリア
A549セルATCCのCCLの185哺乳類細胞株
遠心機エッペンドルフ5810R型
OD600 ディルフォトメーター実装
典型的な醤油グローセルMBPE-4040
F-12KミディアムATCCの 302004A549細胞培養培地
ウシ胎児血清コーニング35-016-CV
名 の の

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Bacterial AdherenceFluorescence ImagingHost CellsEpithelial CellGFP BacteriaPseudomonas AeruginosaMultiplicity Of InfectionDAPI StainingFluorescence MicroscopyA549 Cells

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