細菌感染細胞のカルシウム応答を研究するイメージング技術

要約

出典:Smail, Y., et al. Imaging Ca²⁺ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (2018).

このビデオは、ヒト上皮細胞の赤痢菌感染時に局所的および全体的なカルシウムイオン応答を検出する技術を示しています。赤痢菌は宿主細胞に侵入し、浸潤エフェクターを放出し、細胞内のカルシウムレベルに影響を与えます。局所的および全体的な細胞質カルシウムの振幅と周波数は、蛍光インジケーターを使用して研究されます。

プロトコル

1. 事前準備

1. バクテリアの準備
   1. 0.01%コンゴレッド(CR)を含むトリプチカーゼ大豆(TCS)寒天プレートに、AfaEアドヘシン(M90T-AfaE)を発現する赤痢菌野生型菌株をプレート化し、37°Cで18時間インキュベートします
      手記：再現性を高めるために、ステップ1.1.1で得られた赤痢菌プレートは4°Cで保存し、CR培地上のすべてのコロニーは時間の経過とともに最終的に赤くなるため、1週間以内に使用する必要があります。
   2. ストリークプレートから3つの赤いコロニーを選んで、TCSブロスを培養前に接種します.
      手記： 3つのコロニーでの接種は、病原性プラスミドが遺伝子組換えを受けた単一のクローンを選択する可能性を制限するために行われます。
   3. 振とうインキュベーターで液体細菌培養物を37°C、200rpmで16時間増殖させます。アンピシリンを最終濃度75 mg / mLで添加します。.抗生物質の濃度は、抗生物質の過剰が大きな病原性プラスミドの損失につながる可能性があるため、最小阻害濃度の3倍を超えてはなりません><。 手記：赤痢菌の病原性プラスミドの維持は、適切な抗生物質濃度を補充したCRプレートに細菌培養物をプレーティングすることによって検証する必要があります。白いコロニーの存在はプラスミドの損失を示します。
   4. TCS培養物に細菌のプレカルチャーを1:100の希釈で接種します。37°Cの振とうインキュベーターで200rpmで2時間インキュベートします。600 nm(OD_600nm)での光学密度が0.2〜0.4であることを確認します。
   5. 細菌培養物を13,000 x g、21°Cで2分間遠心分離し、ペレットを等量のEM培地(120 mM NaCl、7 mM KCl、1.8 mM CaCl₂、0.8 mM MgCl₂、5 mM glucose、および25 mM HEPES、pH = 7.3)に再懸濁します。
   6. 細菌懸濁液をEMバッファーで最終外径_600nmの0.1に希釈してすぐに使用するか、21°Cで保存して次の60分以内に使用します。
2. 細胞調製
   1. 1 g/L のグルコースに 10% のウシ胎児血清 (FCS) を添加した DMEM で HeLa 細胞を培養し、10% CO₂ で 37 °C で増殖します。10% FCSおよび非必須アミノ酸を含む4.5 g/Lのグルコースを含むDMEMで増殖させたTC-7を、10% CO₂を含む37°Cのインキュベーターで培養します。
   2. 細胞の維持のためには、コンフルエント状態に関連する増殖接触阻害を避けるために、細胞を定期的に分割します。これは、高いCa²⁺プローブローディング/トランスフェクション効率にとって重要です。
   3. HeLa細胞の実験の前日に、HeLa細胞を3 x 10⁵細胞/ウェルの密度で6ウェルプレートの直径25 mmの滅菌円形カバースリップにプレート
   化します。
   4. TC-7細胞の場合は、細胞をトリプシンしてカウントします。それらを4 x 10⁵細胞/ウェルで播種し、実験の前に10%_CO2インキュベーターで37°Cで5〜7日間インキュベートして分極を可能にします。
      1. 実験日まで毎日細胞培養培地をリフレッシュしてください.
         手記：ガラス底の直径35mmの使い捨てチャンバーは、カバースリップ入りウェルの代替品としても使用できます。後者を使用する場合、加熱されたステージまたは対物レンズによる温度制御が不十分であり、顕微鏡ステージに取り付けられたサーモスタットインキュベーションチャンバーが必要になります。
3. 実験当日は、培地を取り出し、1 mLのEM培地で細胞を21°Cで3回洗浄します。
4. 3 mM Fluo-4/アセトキシメチルエステル(Fluo-4-AM)をEMバッファーに30分間、21°C.
   でロードします。 手記： サブコンフルエントなHeLa細胞のローディングは大きな問題を引き起こさない一方で、分極したTC-7細胞のローディングはしばしば不均一で効率が悪いです。これらの細胞については、Fluo-4-AM含有EMに分散剤であるプルロン酸を最終濃度0.1%で、陰イオントランスポーター阻害剤であるブロモスルホフタレインを最終濃度20μMで添加することにより、ローディング効率が向上することを見出しました。レシオメトリック化学プローブまたはデュアル取得を必要とする遺伝的にコードされたFRETプローブの使用は、局所的なCa²⁺応答のイメージングに必要な取得速度と互換性がありません。
5. サンプルをEMバッファーで3回洗浄し、さらに1 mLのEMバッファーで21°Cでインキュベートして、AM部分の加水分解を可能にします。Fluo-4をロードしたセルは、すぐに、または次の90分以内に使用してください(21°Cに維持してください)。

>2. 感染と局所Ca²⁺応答の画像取得

1. Fluo-4をロードしたセルが入ったカバースリップをイメージングチャンバーまたはガラス底チャンバーに入れます。イメージングチャンバーまたはガラス底ディスポーザブルチャンバーでサンプルをEMバッファーで3回洗浄し、細胞溶解から生じる可能性のある化合物を除去します。EMバッファー1mLを加えます。
2. チャンバーを33°C.
   で加熱した倒立蛍光顕微鏡ステージに置きます。 手記： この温度は、赤痢菌の侵入プロセスと適合する最適な温度と、局所応答を視覚化するためのCa²⁺応答の減速との間の妥協点として選択されます。位相差リングを装備した63倍浸漬油対物レンズ(NA=1.25)を使用しています。
3. 顕微鏡フィールドを選択し、必要に応じて露光時間やビニングなどの取得パラメータを設定して、Fluo-4蛍光シグナルを最適化します><。 手記：ローカルCa²⁺イメージングの主な課題は、振幅が小さく、応答の持続時間が短いため、少なくとも30ミリ秒ごとに取得する必要があることです。市販されているいくつかの裏面照射型電子増倍電荷結合素子(EM-CCD)または相補型金属酸化膜半導体(C-MOS)カメラは、Fluo-4を使用して局所的なCa²⁺応答を検出するために必要な感度を示します。検出感度は、高周波でのFluo-4の蛍光励起に関連する自発的な反応などの光損傷やアーチファクトを制限する上でも重要な問題です。ここでは、470 nmのLEDベースの照明、480 nm±40 nmのバンドパス励起フィルタ、505 nmのダイクロイックフィルタ、および最大強度の5±で使用される527 30 nmのバンドパス発光と1.0のNDフィルタを組み合わせて、限られた時間の取得の流れの下でこれらの問題を最小限に抑えました。120 秒のストリームのバッチによるローカル Ca²+ シグナルの解析が定期的に行われました。これらの低照度条件下では、2分間のストリーム取得中に蛍光色素の光退色は観察されませんでした。同じサンプルで連続した取得を実行できますが、異なるフィールドが使用されている場合に限ります。原則として、最初の取得ストリームは、自発的な応答がないことを確認するために、細菌刺激がない状態で制御場で実行されます。自発的な反応が観察された場合、反応が観察されなくなるまでサンプルをEMバッファーで洗浄します。
4. サンプルに細菌を添加するには、チャンバーから 500 μL の EM バッファーを取り出し、ステップ 1.1.6 で調製した細菌懸濁液 500 μL を加えて、選択した顕微鏡フィールドを動かさないように適切な注意を払って、最終外径_600nm 0.05 を得ます。容量により、細菌が適切に混合され、細胞サンプル上に細菌が均一に分布します。
5. 細菌の添加時に取得を行います。あるいは、細菌の添加の10分後に取得を行い、これは使用した条件下で細菌が細胞に沈殿するのに必要な時間に相当します。取得ストリームの最後に、選択したフィールドの位相コントラスト画像を取得して、細胞に接触する細菌と、細菌の侵入部位に関連する膜フリルを視覚化します。
6. 手順 2.5 と同様に、画像取得、ファイルの保存、およびプロセス全体をカバーする新しいフィールドの選択に適した間隔で、取得手順を繰り返します。
   注:赤痢菌については、10分間の細菌沈降後、5分ごとに20分間の獲得ストリームが、侵入イベントの大部分をカバーできることがわかりました。
7. 取得手順の最後に、最終濃度の 2 μM の Ca²⁺ イオノフォア イオノマイシンサンプルを添加して、Ca²⁺ シグナルの最大振幅を決定します。信号が安定するまで、通常は10分未満で、3〜5秒ごとに画像を取得します。
8. 続いて、Ca²⁺キレート剤エチレングリコール-ビス(β-アミノエチルエーテル)-N、N、N'、N'-四酢酸(EGTA)を最終濃度10 mMで添加し、Ca²⁺非存在下での蛍光シグナルを決定します。信号が安定するまで3〜5秒ごとに画像を取得します。通常は10分未満です
   手記：全球的なCa²⁺変異のダイナミクスは比較的遅いため、これらの取得を3〜5秒ごと(ストリーミングモードではない)に実行し、連続した治療中に同じ顕微鏡フィールドでのCa²⁺イメージングを可能にします。

3. 分析

1. ΔFは関心領域(ROI)の平均蛍光強度の変動を表し、F0は同じROIでのベースライン蛍光を表し、細胞を含まないフィールドの無関係領域が差し引かれます。
   1. ベースラインレベルに対応する、異なるフィールドの各細胞の基礎蛍光レベルを除去します。これらのレベルは、所与のストリーム取得における局所Ca²⁺応答の頻度が低く、比較的短い持続時間であるため、明確に決定することができます。
      注:尋ねられた質問と研究された病原性モデルに関連する回答の顕著な特徴を定量化します。従来は、Ca²⁺シグナルの解析には、局所的または全体的なCa²⁺応答を示す細胞の周波数、これらの応答の持続時間、振幅、周波数など、さまざまなパラメータが考慮されます。赤痢菌と局所的な応答の場合、分析の別の重要な側面は、応答と細菌の侵入部位との空間的関連性です。
2. グローバル応答またはローカル応答を示す応答性細胞の割合を定量化するには、Fluo-4強度の変動に対応する時系列で細胞内のROIを描画します。
   1. 偽陽性のスコアリングを避けるために、平均蛍光強度細胞ベースラインのバックグラウンド変動の3倍の振幅や少なくとも200ミリ秒の持続時間など、局所的なCa²⁺応答を特定するための厳密なパラメータを設定します
      手記：原則として、小さなローカルCa²⁺応答でも、そのプロファイルによってバックグラウンドノイズと区別できます。ROIは、局所的な変動の検出を可能にするのに十分な蛍光シグナルを統合するのに十分な大きさである必要があります。Fluo-4検出の強度に応じて、これらのROIは直径が2〜5mMの範囲の円に対応する場合があります。
   2. 同じ細胞の異なる領域の2つの領域における平均Fluo-4蛍光強度の変動を測定し、応答が局所的か全体的かを判断します。
      手記：多数の細胞の解析は、選択した領域の平均蛍光強度の経時的な変動をオンラインで画面表示できるイメージングソフトウェアの使用によって容易になります。市販のイメージングソフトウェアにはこのようなオプションがありますが、これはIcyフリーウェアを使用してROI Intensity Evolutionプラグインを使用して実行することもできます。
   3. 局所応答を示す細胞の割合を決定します。
      手記：この割合は、顕微鏡フィールドで分析された細胞の総数から計算され、ノンパラメトリック検定を使用して統計的有意性を裏付けるのに十分な数である必要があります。
   4. ローカル応答の期間を決定します。
      手記：局所的なCa²⁺応答は、その持続時間範囲(すなわち、500ミリ秒未満、5〜10秒の間、または10秒以上)および赤痢菌浸潤部位との関連によってさらに区別できます。
3. 応答の振幅を定量化します。まず、ステップ2.1.7で決定した最大Ca²⁺および細胞バックグラウンドレベルを較正します。Fluo-4の負荷は細胞ごとに異なる場合があるため、フィールド内の個々の細胞に対してこれらの決定を実行してください。
   1. 応答の振幅を最大応答の相対的なパーセンテージとして表します。
   2. 正規性検定を使用して統計的検定を実行し、その後にパラメトリック検定を実行して、サンプル間の応答の振幅の潜在的な差を分析します。
   3. これらの応答と細菌の侵入部位との関連は、対応する位相コントラスト画像で視覚化された細菌誘発性膜フリルへのそれぞれの局在化によって決定します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
フルオ-4 AM	インビトゲン	F14201
メタモルフ バージョン 7.7	ユニバーサルイメージング
CoolLED照明システム pE-2	ローパーサイエンティフィック
マイクロディッシュ35mm、高	イビーディ	81156
トリプチカーゼ大豆(TCS)ブロス	サーモフィッシャー	B11768
TCS寒天	サーモフィッシャー	B11043
コンゴレッド	シグマ・アルドリッチ	75768
M90T-アファE	Sun et al. 2017		AfaEアドヘシンを発現するShigella flexneri serotype V.
ipgD-アファE	Sun et al. 2017		AfaEアドヘシンを発現する同質遺伝子ipgD変異株