イメージングフローサイトメトリーを用いたヒトT細胞とSEB負荷Raji細胞との間の免疫シナプスの解析

要約

出典:Wabnitz, G. et al., Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (2019)

このビデオでは、未精製の汎白血球製剤中のT細胞と、SEBをロードしたRaji細胞である黄色ブドウ球菌エンテロトキシンBとの間の免疫シナプス形成を分析しています。CD3およびF-アクチンの濃縮は、イメージングフローサイトメトリーを用いて免疫シナプスで観察されます。

プロトコル

サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。

1. 汎白血球の調製

1. 健康なドナー(または患者)からヘパリン注射器で1mLの末梢血を採取します。献血については、責任ある倫理委員会の承認を得てください。
2. 1 mLのヒト末梢血と30 mLのACK溶解バッファー(150 mM NH₄Cl、1 mM KHCO₃、および0.1 mM EDTA、pH 7.0)を50 mLチューブで混合し、室温で8分間インキュベー
トします。
3. チューブにPBSを充填し、300 x gで6分間遠心分離し、上清を吸引し、ペレットを30 mLのACK溶解バッファーに再懸濁します。
4. 上清が透明になるまで、手順1.2と1.3を繰り返します。最後に、PBSで細胞を洗浄し、室温で300 x gで6分間遠心分離し、細胞ペレットを2 mLの培地(RPMI1640 + 10% FCS)に再懸濁します。細胞を37°Cで60分間インキュベートします。

2. SEBによるRajiセルのロード

1. チューブあたり1.5 x 10⁶ Raji細胞を含む2つの15 mL Falconチューブを準備します。細胞をスピンダウンし(室温で300 x g、6分間)、上清を捨てます。
2. 細胞を残留培地(約50〜100 μL)に再懸濁し、1.9 μL(1.9 μG)SEBを添加し、室温で15分間インキュベートします。5 mLの培養液を加え、細胞をスピンダウンし(室温で300 x gで6分間)、ペレットを1 x 10⁶細胞/mLの密度で培地(RPMI1640 + 10% FCS)に再懸濁します。

3. 免疫シナプスの誘導と染色プロトコル

1. SEBをロードしたRaji細胞の調製を500μL、アンロードしたRaji細胞の調製を別のFACSチューブに500μLをピペットで移します。各チューブに650 μLの汎白血球を加え、細胞をスピンダウンします(室温で10分間300 x g)。上清を捨て、ペレットを150 μLの培地(RPMI1640 + 10% FCS)に再懸濁します。37°Cでインキュベートします(通常45分間)。
2. 細胞を穏やかにボルテックスし(1,000rpmで10秒)、ボルテックス中に1.5 mLのパラホルムアルデヒド(1.5%)を加えて細胞を固定します。1 mLのPBS + 1%BSAを追加して固定を停止します。.細胞をペレット化し(300 x gで室温で10分間)、室温で10分間インキュベートした後、細胞ペレットをPBS + 1% BSAの1 mLに再懸濁します。
3. ペレット(室温で10分間300 x g)し、細胞をPBS + 1% BSA + 0.1%サポニンの100 μLに室温で15分間再懸濁して、細胞を透過処理します(96ウェルプレート、U字型)。
4. PBS + 1% BSA + 0.1% サポニンで細胞を遠心分離 (室温で 300 x g で 10 分間) で洗浄し、細胞ペレットを 50 μL の PBS + 1% BSA + 0.1% サポニン (CD3-PE-TxRed (1:30)、Phalloidin-AF647 (1:150)、DAPI (1:3,000)) に再懸濁します。
5. 室温で暗所で30分間インキュベートし、PBS1 mL + 1% BSA + 0.1%サポニンを加えて細胞を3回洗浄します。300 x gで室温で10分間遠心分離します。細胞を60 μLのPBSに再懸濁して、フローサイトメトリーをイメージングします。

>4. フローサイトメーターによる画像取得

>注:以下の画像取得手順とデータ解析は、imagestream(IS100)、INSPIRE、IDEASなどのソフトウェアを使用したイメージングフローサイトメトリーに基づいています。ただし、他のフローサイトメーターや解析ソフトウェアも使用できます。

1. イメージングフローサイトメーターに接続されたコンピュータで解析ソフトウェアを開き、装置メニューの「Initialize Fluidics」をクリックします。指示されたら、右側のポートにビードを適用します。
2. [ファイル] メニューからデフォルトのテンプレートを読み込み、[実行/セットアップ] をクリックします。[表示]ドロップダウンメニューから[ビーズ]を選択します。
3. 示された値が200未満の場合は、[強度の設定]をクリックして、明視野イルミネーターを調整します。
4. 「Assist」タブで「Start All」をクリックして、キャリブレーションとテストのルーチンを実行します。
5. [Flush/Lock/Load]をクリックし、プロンプトが表示されたら左側のポートにサンプルを適用します。フローサイトメーターに細胞をロードした後、Cell Classifierを開き、各チャネルのピーク強度上限を1,022、チャネル2(DAPI)およびチャネル5(CD3-Pe-TxR)のピーク強度下限50、チャネル1の面積下限50(側方散乱)、上限を1,500に調整します。
6. [セットアップ]タブで、励起レーザー出力を405 nm(15 mW)、488 nm(200 mW)、および647 nm(90 mW)に変更します。
7. ViewドロップダウンメニューをCellsとBeadsの間で切り替えて、細胞分類器とレーザー出力の調整を評価します
   手記：すべてのセルとセルペアがCell Viewで見つかり、Cell Classifiersや励起レーザー出力を変更して、Cell Clumps、Debris、および飽和ピクセルの画像がDebris Viewで見つかることを確認します。
8. 「Setup」タブで、サンプル名と取得する画像の数(サンプルの場合は15,000〜25,000、補正制御の場合は500)を定義します。「Run/Setup」をクリックして取得を開始します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
マルチフュージ3 SR	ヘレウス
RPMIの1640	ライフテクノロジーズ	#11875085	500ミリリットル
FCSの	パンバイオテック #3302-P101102
ポリスチレン丸底チューブ	隼	#352054	5ミリリットル
ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水	シグマ	D8662
ウシ血清アルブミン	ロス	#8076.3
サポニン	シグマ	S7900
パラホルムアルデヒド	シグマ・アルドリッチ	#16005
スピードビード	アムニス	#400041
ミニシェーカーMS1	IKAワークス	MS1
マイクロタイタープレート	グライナーバイオワン	#650101	96ユア
エンテロトキシンSEB	シグマ・アルドリッチ	S4881
ダピ	シグマ・アルドリッチ	D9542	1000対3000の比率
CD3-PeTxR	インビトゲン	MHCD0317	1対30の比率
ファロイジン-AF647	分子プローブ	A22287 (英語)	1対1の50の比率
IS100	アムニス		イメージングフローサイトメーター
アイデア	アムニス		ソフトウェア
吹き込む	アムニス		ソフトウェア

シリーズ の