間葉系幹細胞によるマクロファージ食作用の制御を研究するためのアッセイ

要約

出典:Evans, J. F., et al.マクロファージ食作用の間葉系幹細胞制御;定量とイメージング。 J. Vis. Exp. (2021年)。

このビデオは、共培養におけるマクロファージ食作用の間葉系幹細胞(MSC)制御を研究するアッセイを示しています。MSCをマクロファージと共培養すると、pH感受性蛍光色素に結合した非オプソニン化ザイモサン粒子が添加され、マクロファージによって食作用されます。食作用の増加に伴い、蛍光強度が上昇し、MSCを介した食作用活性の調節を決定することができます。

プロトコル

>注:すべての培地調製および細胞培養技術は、層流のバイオセーフティキャビネットを使用して無菌条件下で実施されます。記載されているすべての培養インキュベーションステップは、37°C、5%CO₂、および95%の湿度を維持するように設計されたインキュベーターを使用して実行されます。

1. 細胞培養

1. 成長培地の調製
   1. MSC(間葉系幹細胞)およびLADMAC(マウス骨髄由来マクロファージ;細胞株を確立した研究者の名前から派生)の場合:Laskin、Dower、およびMalech)、50mLのFBSと5mLの100x抗生物質/抗真菌ミックスを500mLの高グルコースDMEM(ダルベッコの修飾イーグル培地)に加えます。
   2. マクロファージ(MΦ)については、50 mLのFBS、100 mLのLADMAC条件培地(セクション1.2の手順に従って調製)、および5 mLの100倍抗生物質ミックスを500 mLの高グルコースDMEM.
      に加えます。 手記：LADMAC細胞は、MΦ細胞の増殖をサポートするために必要なコロニー刺激因子(CSF-1)を産生します。
2. 共培養の準備として細胞を増殖させる
   1. 凍結ストックからMSC細胞およびMΦ細胞を播種するには、セクション1.1で調製した適切な増殖培地9 mLを、各細胞タイプごとに処理した4つの100 mm細胞培養皿のそれぞれに平衡化し、細胞培養インキュベーターに15分間入れます。
   2. その間、10⁶凍結細胞のアリコートを37°Cの水浴で2〜3分間、またはちょうど解凍するまでインキュベートすることにより、迅速に解凍します。次に、解凍したMSC細胞を9 mLの新鮮なMSC増殖培地に加え、解凍したMΦ細胞を15 mLまたは50 mLの滅菌コニカルチューブ内の9 mLの新鮮なMΦ増殖培地に加え、スイングバケットローターで125 x gで5分間遠心分離します。
   3. 上清を吸引またはデカントし、ピペッティングで静かに上下させて、各ペレットを適切な新鮮増殖培地4 mLに再懸濁します。ステップ1.2.1で平衡化した各細胞タイプの4つの100 mmディッシュのそれぞれに、1 mLの細胞懸濁液を加えます。
   4. 細胞の入った皿をインキュベーターに戻します。70%〜80%がコンフルエントになるまで、2〜3日ごとに培地を交換します。

2. 実験皿にMSCをシード 1日目

注:MSCを播種する前に、蛍光分光光度法用の実験用96ウェルプレートレイアウトとダイナミックイメージング用のチャンバースライドを設計してください。96ウェルプレートの場合、実験用ウェルを細胞を含むウェルで隣接させますが、アッセイでは使用しないでください。試薬ブランク(RBL)に使用するウェルを少なくとも4つマークします。96ウェルテンプレートの例については表1を、4ウェルチャンバースライドテンプレートの例については表2を参照してください。底が透明な黒または白の96ウェルプレートをお勧めします。1.5 mmのホウケイ酸ガラスチャンバースライドが最適ですが、チャンバーの数は研究デザインに応じて調整できます。以下の方法の概要フローチャートを図1に示します。

1. 70%〜80%のコンフルエンシーで、100 mm皿の培養物から増殖培地を吸引し、5 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を加えてMSCを単離します。
2. PBSを吸引し、0.05%トリプシン/ EDTA(エチレンジアミン四酢酸)を2mL加え、培養インキュベーターに3〜5分間置きます。
3. 3分後、倒立顕微鏡で細胞の剥離を確認します。セルが切り離されている場合は、次の手順に進みます。そうでない場合は、さらに1〜2分間インキュベーションを続けます。5〜6分以上インキュベートしないでください。
4. 5 mLの新鮮な増殖培地を、分離した細胞のある皿に加えます。トリプシン/培地混合物を使用して皿をすすぎ、滅菌血清ピペットを使用して細胞を清潔で滅菌した50mLコニカルチューブに収集します。
5. 125 x gで5分間遠心分離します。上清を吸引し、ピペッティングで穏やかに上下させて、細胞ペレットを10 mLの新鮮な増殖培地に再懸濁します。
6. 細胞をカウントするには、1.5 mLの微量遠心チューブに10 μLの細胞懸濁液を30 μLの0.4%トリパンブルー溶液に加えます。次に、血球計算盤計数室のカバーガラスの下に混合物10μLをピペットで移します。
7. 倒立顕微鏡または明視野顕微鏡を使用し、10倍対物レンズを使用して、1 mm²の正方形のうち4つで未染色(生存)細胞をカウントします。次の式を使用してセル番号を計算します:cells/mL = cell count/# 1 mm² square x dilution factor x 10⁴.
   手記：この例では、カウントされる 1 mm² マスの数は 4 で、希釈係数は 4 です。
8. 式 C₁V₁ = C₂V₂ を使用して、1 x 10⁵ 細胞/mL懸濁液を計算し、調製します。プレートの設計に従って、充填する96ウェルプレートの各カラムに1 mLの細胞/mL懸濁液を調製し、充填する4ウェルチャンバースライドのチャンバーごとに0.75 mLを調製します
   手記： C₁ = 細胞数、V₁ = 計算対象、C₂ = 1 x 10⁵、V₂ = 5.50 mL。
9. V 1を決定し、総容量の所望の5.50 mLから_V1を差し引いて、懸濁液の調製に必要な新鮮な培地の容量を決定します。元の懸濁液の細胞量(V₁)を新鮮な培地の容量に加えて、1 x 10⁵ cells/mL で合計 5.50 mL にします。
10. 1 x 10⁵ cell/mL懸濁液を、プレート設計に従ってマルチチャンネルマイクロピペッターを使用して96ウェルプレートの各ウェルに100 μLを、プレート設計に従ってマイクロピペットを使用してチャンバースライドの各ウェルに530 μLを添加します。一晩インキュベートします.
    手記：この実験では、MSCを96ウェルプレートのカラム1、2、3、および6、および4ウェルチャンバースライドのウェル1および2(表2)に播種します。したがって、少なくとも 5.50 mL の 1 x 10⁵ 細胞/mL 懸濁液を調製します。80%コンフルエンスのMΦは、MSCが実験プレートに播種されたのと同じ日に炎症メディエーターで処理されます。

3. MΦを分離し、共培養を準備する、2日目

1. MΦ細胞から活性化培地を取り出し、5 mLの新鮮な増殖培地と交換します。セルリフターで優しくこすり落とし、細胞を50mLの円錐形チューブに集めます。
2. ステップ2.6-2.7のMSCについて説明したように、トリパンブルー排除と血球計算法を使用して細胞をカウントします。
3. ステップ 2.8 から 2.9 の式を使用して、2 x 10⁵ 細胞/mL の 2 つの別々の懸濁液を調製し、1 つはコントロールの細胞、もう 1 つは処理した MΦ 培養の細胞を調製します
   手記：プレートの設計に従って、充填する96ウェルプレートの各カラムに1 mL、充填する4ウェルチャンバースライドのチャンバーごとに0.75 mLの細胞/mL懸濁液を準備します。
4. MSCを含む96ウェルプレートの実験ウェルから培地を穏やかに吸引します。マルチチャンネルマイクロピペットを使用して、プレート設計に従って、処理したMΦ細胞懸濁液とコントロールMΦ細胞懸濁液を100μLをMSCの有無にかかわらず適切な実験ウェルに加えます。一晩インキュベートします。
5. MSCを含む4ウェルチャンバースライドから培地を穏やかに吸引し、マイクロピペットを使用して、設計に従って530μLのMΦ細胞懸濁液を適切なウェルに加えます。一晩インキュベートします。

>4. 食作用アッセイ、キネティック蛍光96ウェルプレート読み取り、3日目

1. アッセイパラメータの設定
   1. アッセイ当日は、蛍光プレートリーダーの電源を入れ、システムの温度をコンピューターで37°Cに設定します。
   2. System Proソフトウェアを開き、左上隅にある測定器のアイコンを確認して、測定器がコンピューターに接続されているかどうかを確認します。線の付いた赤い円が表示されている場合は、楽器のアイコンをクリックし、ポップアップウィンドウで楽器を選択して接続します。
   3. New Experiment(新規実験)を選択して、Plate Set-Up Helper(プレートセットアップヘルパー)ポップアップウィンドウにアクセスします。プレートセットアップヘルパーメニューから、データ収集設定の構成を選択します。
   4. 光学構成の設定メニューから[モノクロメーター]を選択します。読み取りモードにはFL(蛍光)を、読み取りタイプにはキネティックを選択します。
   5. 同じ構成ウィンドウの [Category] で [Wavelengths] をクリックし、帯域幅を励起用に 9 nm、放射用に 15 nm に設定します。
   6. 波長ペアの数を 1 に設定します。波長LM1を励起用波長510nm、発光用波長540nmに設定します。
   7. カテゴリを続行し、次に[プレートタイプ]を選択します。使用するプレートの種類に一致するオプションを選択します。
      手記：選択がプレートの種類と一致することが重要です。読み取られた高さは、選択内容に応じてシステムによって設定されます。
   8. 次に、Read Areaを選択し、実験デザインに含まれる96ウェルプレートの領域を強調表示します。
   9. [PMT] と [Optics] を選択し、[PMT Gain] を [High] に、[Flashes per read] を 6 に設定します。クリアボトムプレートを使用している場合は、下から読み取りの横にあるチェックボックスをオンにします。
   10. [タイミング] を選択し、70 分間で 10 分間隔に設定します。
   11. [シェイク] を選択し、[最初の読み取り前] ボックスをオンにして、5 秒間に設定します。[読み取り間] ボックスをオンにして、3 秒間に設定します。両方の揺れの強さを「低」と「リニア」に設定します。
   12. ウィンドウを閉じます。プレートセットアップヘルパーウィンドウが表示されたら、[プレートレイアウトの設定]を選択します。プレートデザインのBLウェルを強調表示し、プレートブランクをクリックします。
   13. 実験の各行を強調表示し、[追加] をクリックし、グループに名前を付けて、色を選択します。
   14. プレートデザインの下の[割り当てオプション]で[シリーズ]を選択し、ウィンドウでシリーズを定義して[OK]をクリックします。グループごとに繰り返します。
2. ザイモサン懸濁液を準備します
   1. システム温度が37°Cに達するのを待つ間に、1 mgのザイモサン粒子を5 mLの生細胞イメージング培地に再懸濁します。
      1. 粒子を含むバイアルに1 mLの生細胞イメージング培地を加え、ガラス製培養チューブに集めます。バイアルを追加の1 mLイメージング溶液ですすぎ、同じガラス管に移して、すべての粒子が転写されていることを確認します。3 mLのイメージング溶液を添加して、0.2 mg/mLの粒子懸濁液を得ます。
   2. 30〜60秒間のクイックパルスで渦を巻きます。次に、プローブソニケーターを使用して、60回のクイックパルスで超音波処理します><。 手記：粒子の均質な懸濁液を作成し、懸濁液を実験用ウェルに追加する前に長時間放置しないことが非常に重要です。凝集は急速に繰り返されます。細胞あたりの粒子密度は、使用するMΦのソース、処理、および密度に応じて最適化する必要がある場合があります。提示された研究では、共役ザイモサン粒子が使用されました。ただし、抱合型大腸菌と黄色ブドウ球菌も利用可能です。
3. ザイモサンを加えてプレートを読み取ります
   1. 実験用ウェルから培地を吸引し、100 μLの生細胞イメージング溶液で1回すすぎます。RBLウェルも生細胞イメージング溶液ですすいでください。
   2. 実験用ウェルとRBLウェルから生細胞イメージング溶液を吸引し、100 μLのザイモサン粒子懸濁液と交換します。
   3. 蛍光リーダーのプレートトレイをタッチパッドインターフェースで開きます。プレートを蓋なしでトレイにセットし、A1ウェルを左上隅に置きます。タッチパッドを使用してトレイを閉じ、トップメニューの緑色の[読み取り]ボタンをクリックします。
   4. 読み取りが完了したら、ファイルを適切なフォルダに保存し、[ファイル]をクリックして[エクスポート]を選択して、データをスプレッドシート形式でエクスポートします。
   5. スプレッドシート(補足ファイル1)で、各時点(10分、20分、30分など)における各反復群のSEM相対蛍光の平均±を計算し、グラフ作成ソフトウェアにデータを転送します。
   6. 折れ線グラフ形式を使用してデータを表示し、二元配置分散分析 (因子としての時間 x 処理/MSC) を適用し、その後にテューキーの多重比較検定を適用して個々のグループ間の違いを決定します。
      手記：96ウェルプレートの読み取りが進行中の間に、タイムラプス画像取得用のダイナミックイメージングプレートを準備します。ダイナミックイメージングが一度に1つの実験ウェルの解析に進むことを確認します。

>表1:96ウェルプレート設計の例。 CBL - セルブランク。MSC - シード日1。MΦ+処理済みおよびMΦ未処理のシード日2。RBL試薬ブランクをアッセイ3日目に追加しました。

名 の の の の の の の の

	1	2	3	4	5	6	7
ある	CBLの	MSC/MΦ	MSC/MΦ+	MΦの	Mφ+(エムφプラス)	CBLの	RBLの
イ	CBLの	MSC/MΦ	MSC/MΦ+	MΦの	Mφ+(エムφプラス)	CBLの	RBLの
ハ	CBLの	MSC/MΦ	MSC/MΦ+	MΦの	Mφ+(エムφプラス)	CBLの	RBLの
ダ	CBLの	MSC/MΦ	MSC/MΦ+	MΦの	Mφ+(エムφプラス)	CBLの	RBLの
E	CBLの	MSC/MΦ	MSC/MΦ+	MΦの	Mφ+(エムφプラス)	CBLの	RBLの
エフ	CBLの	MSC/MΦ	MSC/MΦ+	MΦの	Mφ+(エムφプラス)	CBLの	RBLの
Gさん	CBLの	MSC/MΦ	MSC/MΦ+	MΦの	Mφ+(エムφプラス)	CBLの	RBLの
H	CBLの	MSC/MΦ	MSC/MΦ+	MΦの	Mφ+(エムφプラス)	CBLの	RBLの

表2:4ウェルチャンバースライド設計の例。MSC - メッキ1日目。MΦ+処理済み、MΦ未処理メッキ2日目。

の

1	2	3	4
MSC/MΦ	MSC/MΦ+	MΦの	Mφ+(エムφプラス)

結果

図1:共培養および食作用アッセイのワークフローの概要。MSCとの共培養におけるMΦ食作用活性の定量的および定性的な分析のためのワークフローの概要。

>補足ファイル1:最適な実験からの生の動力学的データの代表的なスプレッドシートファイル。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
96ウェルブラックポリスチレンマイクロプレート	ミリポアシグマ	CLS3603-48EA
0.4%トリパンブルー溶液	ミリポアシグマ	T8154-20ミリリットル
15 mLおよび50 mL円錐形滅菌ポリプロピレン遠心分離チューブ	サーモフィッシャー	339653
抗生物質-抗真菌薬(100X)Gibco	サーモフィッシャー	15240096
セルリフター	ミリポアシグマ	CLS3008-100EA
培養フラスコ、組織培養処理済み、表面積75 cm2、傾斜ネック、キャップ付き、フィルター付き	ミリポアシグマ	C7231-120EA
D1 ORL UVA [D1]	ATCCの	CRL-12424	マウスMSC細胞株
DMEM、高グルコース	サーモフィッシャー	11965092
ウシ胎児血清、認定済み、熱不活化	サーモフィッシャー	16140071
血球計算盤	フィッシャーサイエンティフィック	02-671-51B(英語)
I-11.15	ATCCの	CRL-2470	マウスMΦ細胞株
LADMAC細胞株	ATCCの	CRL-2420	LADMAC細胞は、成長因子コロニー刺激因子1(CSF-1)を分泌します。
ライブセルイメージングソリューション	サーモフィッシャー	A14291DJ
PBS、pH 7.4	サーモフィッシャー	10010031
pH Rhodo Green Zymosan バイオパーティクルコンジュゲート	サーモフィッシャー	P35365
Spectramax i3Xの	分子デバイス
滅菌シングルユース真空フィルターユニット、250 mL、0.2 μm	サーモフィッシャー	〒568-0020
滅菌シリンジフィルター、0.2マイクロメートル	サーモフィッシャー	〒723-2520
組織培養処理培養皿 100 mm x 20 mm	ミリポアシグマ	CLS430167-100EA
トリプシン-EDTA(0.05%)、フェノールレッド	サーモフィッシャー	25300054