サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。
1. チャネルスライドにおける腹膜細胞の播種
- 腹膜マウスマクロファージ細胞懸濁液を上下にピペッティングして凝集を減らした後、フィブロネクチンコーティングされたチャネルスライド(100 μLチャネルの寸法(長さ×幅×高さ)50 mm x 5 mm 0.4 mm)のプレフィルドチャネル(容量、100 μL)に100 μL懸濁液をピペットで注入します。
- 1 mLの血清添加RPMI 1640(Hepes)培地をチャネルスライドの2つのリザーバーのいずれかに添加し、スライドを傾けてから、下流のリザーバーから培地を吸引して、チャンバーに事前充填します(図1)。
- 2つのリザーバーのいずれかに1〜2 mLの培地を追加し、リザーバーキャップをしっかりと適用し、キャップにリズミカルな親指の圧力で空気を送り出し、必要に応じてスライドを傾けて、チャネル内の不要な気泡または長い空気片を取り除きます。空気を排出した後、キャップを取り外す前に、キャップのないリザーバー(および含まれている媒体)を使用してスライドを下に傾けて、空気がチャネルに吸い込まれるのを防ぎます。
- 細胞を播種したチャネルスライドを、CO2 非存在下で湿ったチャンバー内で 37 °C で 2 時間インキュベートします (HCO3-/CO2 バッファー系は Hepes に置き換えられるため、CO2 は必要ありません)。チャンネルスライドは、8枚のスライドを収納できるラックに便利に配置できます。通常、1つのマウスから6〜8枚のスライドが準備されますが、最大10枚以上も可能です。
- ラックを取り外し、各スライドのRPMI 1640(Hepes)培地を、重炭酸塩を含むRPMI 1640培地に10%ウシ胎児血清とペニシリン/ストレプトマイシンを添加したものと交換します。
- スライドを傾け、最初に下部のリザーバーから、次に上部のリザーバーから媒体を吸引します。次に、新しい培地 1 mL をリザーバーの 1 つに加え、スライドを傾けて、チャネルを流れた後、下流のリザーバーから培地を吸引します。
- この洗浄(培地交換)ステップの後、リザーバーの1つに1 mLの培地を加えてチャネルスライドを充填します
手記：チャネルスライドを使用した洗浄ステップは、溶液交換と非接着性細胞の除去の点で非常に簡単で効果的です。RPMI 1640(重炭酸塩)培地は、通常、5%のCO2と一晩で事前にインキュベートされ、熱およびpHの平衡を確保します。
- 細胞を加湿インキュベーターで37°Cで一晩インキュベートし、5%CO2でインキュベートします。翌日に実験を行います。
2. ヒト赤血球の単離
- 2日目(実験の2日目;単離された腹膜マクロファージの一晩のインキュベーション後)に、健康なドナーから1〜2 mLの末梢静脈血をヘパリンチューブに採取します。丸底の2.0 mL(ポリプロピレン)マイクロ遠心チューブに1 mLを移し、300 x gで18°Cで5分間遠心分離し(経験的設定)、上清(血漿およびバフィーコート)を除去します。
- 沈殿した赤血球100 μLを穏やかに吸引し、この容量を改質RPMI 1640(Hepes)培地(後述)と1:1で混合し、丸底の2.0 mL微量遠心チューブに入れます。チューブに「1:1」のラベルを付けます。
手記：細胞単離後の2日目(アッセイ用)に使用したRPMI 1640(Hepes)培地には、10%の熱不活化ウシ胎児血清に加えて、ペニシリン(100単位/mL)、ストレプトマイシン(100μg/mL)、および1 mM N-(2-メルカプトプロピオニル)グリシン(光毒性を低減するため)が含まれています。以下、この培地を「改質」RPMI 1640(Hepes)培地と呼びます。
- 1:1で希釈した赤血球懸濁液4 μLを2 mLの改変RPMI 1640(Hepes)培地にピペットで移し、2.0 mLの微量遠心チューブにあらかじめピペットで移します(このステップを繰り返します。つまり、2本のチューブを準備します)。各チューブに「4:2000」のラベルを付けます。「1:1」と「4:2000」のチューブを氷の上に置きます。
>3. マクロファージ原形質膜の標識
- 播種したチャネルスライドをCO2インキュベーターから取り出し、各スライドのRPMI 1640(重炭酸塩)培地を改質RPMI 1640(Hepes)培地と交換します。次に、CO2.
の非存在下で、細胞を 37 °C の湿ったチャンバーに入れます
手記：一晩のインキュベーションと洗浄の後、ほとんどのリンパ球がチャネルから除去されます。残りの接着細胞の大部分はマクロファージであり、形態学的に、または抗F4/80抗体を用いた免疫蛍光染色によって同定することができます。マウスに常在する腹膜マクロファージの約95%がF4/80陽性です。
- 蛍光緑色標識抗マウスF4/80抗体(4°Cで保存)を改変RPMI 1640(Hepes)培地で1:40希釈します。スライドを手に取り、傾けて、100 μLの抗体混合物をスライドの100 μLチャネルの開口部にピペットで(一滴ずつ)入れます(図1を参照)。下流の貯留層に流れ込む媒体を吸引します。細胞を37°Cで20分間インキュベートします(加湿環境、CO2なし)。潜伏期間中、ヒト赤血球を標識します(セクション5を参照).
手記：上記で述べたように、HCO3-/CO2緩衝系はHepesに置き換えられるため、CO2は必要ありません。
- 20分間のインキュベーション時間(ヒト赤血球を染色してオプソニン化する)後、1 mLの改変RPMI 1640(Hepes)培地をリザーバーの1つに加えてスライドを洗浄し、チャネルを流れた後、スライドを傾けることで培地を吸引します。1 mLの培地を添加して短期保存するか、実験に進みます(すなわち、粒子(オプソニン化赤血球)のピペッティングおよびタイムラプススピニングディスク共焦点顕微鏡による食作用のイメージング)。
4. ヒト赤血球の原形質膜の標識
- マクロファージのスライドを緑色蛍光標識抗F4/80抗体とインキュベートした直後(セクション3.2以降)にヒト赤血球の標識を開始します。穏やかに混合した後、「4:2000」チューブの1つ(セクション2.3を参照)から400μLを取り出し、(丸底の)2.0mL微量遠心チューブに分注します。懸濁液が約37°Cに温まるまで待ちます(以下の段落を参照)。0.4 μLのオレンジ/赤色蛍光原形質膜染色剤(アリコートは-20°Cで保存)を加え、37°Cで5分間インキュベート<>
手記：層流フードの内側に配置された加熱されたアルミニウムブロックは、スライドを準備する際の熱損失を最小限に抑えるのに役立ちます。チューブは加熱ブロックのボアウェルに配置でき、別の、または統合された加熱されたアルミニウムプレートが作業スペースとして機能します。
- 5分間のインキュベーション期間後、1600 μLの改変RPMI 1640(Hepes)培地(2.0 mLの微量遠心チューブを満たすため)を加えて、最初の洗浄ステップを準備します。
- チューブを300 x gで18°Cで5分間遠心分離します(経験的設定)。チューブの底の壁(つまり、中心から外れた部分)にコンパクトな赤いペレットが見える必要があります。ペレットが上を向くようにチューブを回転させ、1〜1.5 mLのピペットチップを使用して、すべての上清を連続して(2ステップで)慎重に除去します。
- 上清を吸引した後、2,000 μLの改変RPMI 1640(Hepes)培地を加え、混合(細胞を再懸濁)し、上記の遠心分離と上清の吸引ステップを繰り返します。
- ペレット(原形質膜染色し、2倍洗浄した赤血球)を400μLの改変RPMI 1640(Hepes)培地で再懸濁します。チューブにPMS(原形質膜染色の略)にラベルを付けます
手記：あるいは、pH感受性ローダミン誘導体のスクシンイミジルエステルは、酸性pHでより強く蛍光を発し、ヒト赤血球の標識に使用できる可能性があります。この場合、蛍光強度は、粒子が内在化された後のファゴソーム成熟の尺度としても機能します。
>5. マウス免疫グロブリンG(IgG)によるヒト赤血球のオプソニン化(標識)
- 400 μL培地に懸濁した原形質膜で染色されたヒト赤血球を含むPMS標識チューブ(セクション4.2–4.5を参照)に、1 μLマウス(IgG2b)モノクローナル(クローンHIR2)抗ヒトCD235a抗体(-20°Cで保存)を加えます。CD235a(グリコフォリンAとしても知られています)は、赤血球系特異的膜シアロ糖タンパク質です。
- 37°Cで8分間インキュベートします。IgGによるヒト赤血球のオプソニン化は凝集(細胞凝集)を引き起こすことに注意してください。凝集はオプソニン化の視覚的な指標として役立ちますが、単一の食作用のイメージングには望ましくありません。凝集を回避するには、たとえば、200 μLに設定された可変容量の20〜200 μLピペットを使用して、細胞懸濁液を繰り返し混合します(1分ごと)。
- 8分間のインキュベーション期間の終わり頃に、必要に応じて、蛍光標識された緑色の抗F4/80抗体とインキュベートしたマクロファージスライドを、1 mLの修飾RPMI 1640(Hepes)培地で洗浄します。洗浄ステップの後、チャネルスライドの両方のリザーバーに媒体がないことを確認してください。
>6. 原形質膜染色およびIgG被覆ヒト赤血球の食作用のイメージング
- 抗CD235a抗体と8分間インキュベートした後(セクション5.2)、原形質膜染色およびIgGオプソン化ヒト赤血球を含む100 μL懸濁液を、緑色蛍光抗F4/80抗体で標識されたマクロファージを含むスライドのチャネルにピペットで注入します(ステップ3)。したがって、赤色蛍光性のIgGオプソニン化ヒト赤血球が緑色蛍光食細胞(マクロファージ)に添加されます。
- ヒト赤血球を添加したらすぐに、チャネルスライドをスピニングディスク共焦点顕微鏡(ステージインキュベーターを37°Cに設定)に取り付けて、たとえば60倍/1.49油浸対物レンズを介してイメージングします。粒子は1分以内に沈降し始めるため、できるだけ早くイメージングを開始してください
手記： 直径100nmの蛍光ビーズを用いて、点像分布関数の解析により、XY分解能x=0.22μm、y=0.23μm(488nmレーザー)、x=0.27μm、y=0.27μm(561nmレーザー)を測定しました。しかし、生細胞のタイムラプス3Dイメージング中の光退色と光毒性を低減するために、2 x 2ビニングを使用して空間分解能を妥協します。ビニングは感度を向上させます(信号対雑音比を改善します)と許容フレームレートですが、空間解像度が犠牲になります。
- パーフェクトフォーカス(または同様の)システムを使用して、録画中のフォーカスドリフトを防ぎます。パーフェクトフォーカスシステムをアクティブにした後、オフセットコントロールを使用して、チャネルスライドのカバースリップ(下記の注を参照)のすぐ上にあるマクロファージラメリポディアル突起に焦点を合わせます。このフォーカスレベルはZ = 0 μmに相当します。0.8 μmステップで-1 μmから+16 μmまでのZスタックを取得し、これは22個のZスライスに相当します。たとえば、Zスタックは、15秒ごとに1スタック(チャネルごとに)の割合で取得でき、合計で16分
手記：記録時間が長くなると、主に光退色による画質の低下が生じます。Zスタックは、2つのチャネルのそれぞれについて取得されます:マクロファージは488 nmレーザー(緑チャネル)を使用してイメージングされ、ヒト赤血球は561 nmレーザー(赤チャネル)を使用してイメージングされます。このアプローチを使用すると、異なる時点でIgGオプソニン化ヒト赤血球を摂取しているマクロファージのさまざまなビューを取得できます(たとえば、図2を参照).
手記：システムの一般的な設定(2 x 2ビニング付き)は、グリーンチャンネル(20.5%レーザー(50 mW; 488 nm)出力、101感度(範囲、0〜255)、および200 msの露光時間)です。赤チャンネル(10.5%レーザー(50 mW; 561 nm)出力、101感度(範囲、0-255)および98 ms露光時間).
手記：チャネルスライドの底部は、#1.5ガラスカバースリップと同じ厚さとガラスと同じ光学特性を持つポリマーですが、特に、この材料にはガス透過性という利点があります。
