がん細胞に対するナチュラルキラー細胞媒介性細胞毒性を評価するためのカルセインアセトキシメチル染色

要約

出典: Chava, S. et al., Measurement of Natural Killer Cell-Mediated Cytotoxicity and Migration in the Context of Hepatic Tumor Cells. J. Vis. Exp. (2020年)

このビデオは、カルセインAM染色剤を使用して、がん細胞に対するナチュラルキラー細胞の細胞毒性を測定するアッセイを示しています。ナチュラルキラー細胞との共培養後に蛍光がん細胞の数が減少することは、ナチュラルキラー細胞ががん細胞に対して細胞毒性を示すことを示しています。

プロトコル

1. カルセインAM染色法によるNK細胞性細胞毒性の顕微鏡的測定法

1. SK-HEP-1細胞を70−80%のコンフルエント度まで培養します。最初に5 mLの1x PBSで細胞を洗浄し、続いて1 mLの0.25%トリプシン-EDTAでインキュベートすることにより、シングルセル懸濁液を生成します。
2. SK-HEP-1細胞を1 mLの滅菌遠心チューブで160 x gで3分間遠心分離し、ペレットを3 mLの無血清DMEMに再懸濁します。
3. 1.5 μLのカルセインAM溶液(10 mM)をSK-HEP-1細胞に加え、室温で30分間インキュベートします。カルセインAM標識SK-HEP-1細胞を160 x gで15 mLの滅菌遠心チューブで3分間遠心分離します。
4. 5 mLの1x PBSで細胞を2回洗浄し、余分なcalcein AM色素を除去します。
5. 並行して、NK92MI細胞を160 x gで15 mLの滅菌遠心チューブで3分間遠心分離します。細胞ペレットを5 mLの1x PBSで一度洗浄し、5 mLのNK92MI細胞培地に再懸濁します。
6. カルセインAM標識SK-HEP-1細胞およびNK92MI細胞を、血球計算盤または自動セルカウンターを使用してカウントします。
7. SK-HEP-1細胞を1 x 10⁵細胞/mLの培養培地に再懸濁し、NK92MI細胞を1 x 10⁶細胞/mLのNK細胞培地に再懸濁します。
8. カルセインAM標識SK-HEP-1細胞(標的細胞)(1 x 10⁴/100 μL/ウェル)とNK92MI細胞(エフェクター細胞)(1 x 10⁵/100 μL/ウェル)(1:10ターゲット:エフェクター比)を96ウェルプレートのトリプリケートウェルでウェルあたり
プレート化します。
9. 96ウェルプレートを37°Cで、95%の空気と5%のCO₂の雰囲気で4時間インキュベートします。インキュベーション後、カルセインAM標識細胞の蛍光顕微鏡を10倍の倍率で撮影します。各治療条件について、各レプリケートの少なくとも 10 の異なるフィールドをキャプチャします。
10. 各複製について10枚の画像をランダムに選択し、NK92MI細胞の有無にかかわらずインキュベートされたカルセインAM陽性標識標的細胞をカウントします。以下の式を使用して % 細胞毒性を計算します。
    
    手記：コントロールとして、NK92MI細胞を含まない標的細胞と完全に溶解した標的細胞を完全な溶解コントロールとして使用します。完全溶解のためには、0.5% Triton X-100で細胞を1時間インキュベートします(200 μLの培地に20 μLの5% Triton X-100
を充填)。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
カルセインAM染料	シグマ・アルドリッチ	17783
DMEM	ギブコ	11965-092
ウシ胎児血清	ギブコ	26140079
ホースセラム	ギブコ	16050114
NK92MI細胞	ATCCの	CRL-2408
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)	シグマ・アルドリッチ	P4417
SKHEP-1 セル	ATCCの	HTB-52
トリプシンEDTA溶液	ギブコ	25200056

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