走化性刺激に応答したナチュラルキラー細胞の移動の測定

要約

出典:Chava, S., et al. 肝臓腫瘍細胞の文脈におけるナチュラルキラー細胞媒介性細胞毒性および移動の測定。 (2020年)。

このビデオは、多孔質膜インサートシステムを介したナチュラルキラー(NK)細胞の走破性物質に対する反応を研究する方法を示しています。この方法により、フローサイトメトリーを用いたNK細胞の遊走の定量解析が可能になります。

プロトコル

1. NK細胞移動アッセイ

1. NK92MI細胞および遠心分離用細胞を160 x gで15 mLの滅菌遠心チューブ内で3分間増殖します。
2. 細胞ペレットを5 mLの1x PBSで2回洗浄し、細胞を3 mLの無血清NK92MI細胞培地に再懸濁します。NK92MI細胞は、血球計算盤または自動セルカウンターを使用してカウントします。
3. トランズウェル透過チャンバー(直径6.5 mmのインサートと5 μmの孔径)の上部コンパートメントにあるプレートNK92MI細胞(2.5 x 10⁵細胞/100 μL/ウェル)。
4. ボトムチャンバーに、NK細胞の化学誘引性特性について試験する材料を含む0.6 mLの無血清培地(馴化培地、ケモカイン、サイトカインなど)を加えます。
   手記：馴化培地を調製する際は、血清を添加していない低血清培地を使用して、移行アッセイにおける血清タンパク質からの干渉を排除します。
5. 24ウェル透過性チャンバーを37°Cで4時間インキュベートします。4時間後、非接着性で移動したNK92MI細胞を下部チャンバーから回収し、蛍光活性化セルソーティング(FACS)チューブに移してさらに分析します
   手記：培養時間は、標的細胞の種類、および標的細胞によって産生されるケモカインの量と動態によって異なります。したがって、この時間は、細胞の種類、ケモカイン、および実験ごとに経験的に決定する必要があります。
6. フローサイトメトリー用のカウントビーズをあらかじめ決められた数で50 μLの容量で、遊走したNK細胞を含む各チューブに加えます。300 μL/ウェルの細胞懸濁液の容量を、FACSベースの自動細胞計数が可能なフローサイトメーターで評価できます
   手記： フローサイトメトリー用の計数ビーズを毎回十分に混合またはボルテックス混合して、実験のばらつきを最小限に抑えるために一定数のビーズが使用されるようにします。精度を維持するために、カウントビーズを使用したリバースピペッティングをお勧めします。FACS解析コントロールとしては、NK細胞とフローサイトメトリー用のカウントビーズのみを使用してください。著者らは、少なくとも10,000個のビーズ+NK細胞を組み合わせることを推奨しており、この量はうまく機能しています。ただし、この数は実験条件によって異なる場合があります。したがって、ビーズ+NK細胞の組み合わせ数は、実験の種類ごとに経験的に決定する必要があります。さらに、生物学的トリプリケートを使用して実験を行い、統計的に有意な結果を達成し、異なる細胞数間のばらつきを考慮することが重要です。
7. 次の式を使用して、移行されたNK92MIセルの絶対数を計算します:
   
   ここで、A = 細胞数、B = ビーズ数、C = ロットに割り当てられたビーズ数 (フローサイトメトリーのカウントビーズ数/50 μL、この例では 49,500)、D = サンプルの量 (μL).
   手記：300 μLのサンプル容量(移行細胞)をFACS分析に使用し、50 μLのカウントビーズをフローサイトメトリーに使用した場合、移行細胞の絶対数 = 1,700 細胞 / 3,300 ビーズイベント x 49,500 ビーズ/300 μL = 84.975 細胞/μL となります。サンプルが希釈されている場合、または異なる量のFACS計数ビーズが使用されている場合は、計算を修正する必要があります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
絶対計数ビーズ	サーモフィッシャーサイエンティフィック	C36950
NK92MI細胞	ATCCの	CRL-2408
SKHEP-1 セル	ATCCの	HTB-52
トランズウェル透過性チャンバー	共演者	3241
オプティMEM	ギブコ	31985070
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)	シグマ・アルドリッチ	P4417
アルファ-MEM	シグマ・アルドリッチ	M4256

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