抗体の補体媒介性殺菌活性に関する血清殺菌アッセイ

Abstract

出典:Weerts, H. P., et al. A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay. J. Vis. Exp. (2019).

このビデオは、血清中に存在する抗体の補体媒介性殺菌活性を評価する技術を示しています。このアプローチは、単離された血清を病原性細菌および外因性補体タンパク質と組み合わせます。インキュベーション後、細菌を寒天プレート上で増殖させ、産生されたコロニーを定量して血清殺菌力価を測定します。

Protocol

1. 補体とターゲット細菌を調製する

1. 赤ちゃんウサギの補遺(BRC)
   を準備します 注:補体ロット選択の詳細な基準は、こちらでご覧いただけます https://www.vaccine.uab.edu/uploads/mdocs/UAB-MOPA.pdf
   1. 冷凍BRCを入手し、流水冷水で解凍します。BRCを完全に解凍するまで、10~20分ごとに物理的に混合します。BRCを凍結融解サイクルにさらさないでください。
   2. BRCの解凍中に、1.5 mL、5 mL、または15 mLの遠心チューブにラベルを付けます。ラベル付きのチューブを氷上に置いて予冷します。予冷した遠心分離管に適切な量のBRCを分注します(充填後、すぐに各チューブを氷に戻します)。アリコートは≤-70°Cで冷凍庫に保管します.
      手記： 各アッセイプレートには約1 mLの補体が必要です。補体アリコートは単回使用用であり、アッセイレイアウトに適した量で分注する必要があります。
   3. 熱不活化BRCを調製するには、活性BRCの1アリコートを解凍します。56°Cのウォーターバスを準備します。BRCが完全に解凍されたら、それをウォーターバスに移し、30分間インキュベートします。
   4. インキュベーション後、熱不活化BRCをウォーターバスから取り出し、室温(R....

Results

図1:カラーデベロップ後のLBAプレート。代表的なS. flexneri 3a細菌のマイクロコロニーは、一晩で適切なサイズに成長しました。オーバーレイ寒天を添加し、オーバーレイ寒天中のTTC化合物を還元することにより、コロニーが赤色に発達しました。

図2:NISTのIntegrated Colony Enumerator(NICE)ソフトウェアインターフェース。 NICEソフトウェアインターフェースのグラフィカル表現。関心領域(ROI)は、カウントする前に各スポットのコロニーを中心.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ゼラチン	シグマ	G9391	タイプB、粉末、BioReagent、細胞培養に適しています
TTC(2,3,5-トリフェニルテトラゾリウムクロリド)	シグマ	T8877	≥98.0%(高性能液体クロマトグラフィー)
アジ化ナトリウム(NaN3)	シグマ	S2002	≥99.5%
ベビーラビットコンプリメント	ペルフリーズ	31061から3	生後3-4週
Ca2+/Mg2+ の HBSS	インビトゲン	14065-56	フェノールレッドなし
LB寒天(レノックス)	シグマ	L2897	粉末微生物増殖培地
バクト寒天	BDの	214010	粉末、(C12H18O9)n
グリセロール	シグマ	G5516	分子生物学の場合、≥99%
LBブロス(レノックス)	シグマ	L3022	粉末微生物増殖培地
スクエアシャーレ	シグマ	Z617679-240EA	120 mm x 120 mm
アッセイプレート	共演者	3799	蓋付き96ウェルU底プレート
NICEソフトウェア	アラバマ大学バーミンガム校		ftp://ftp.nist.gov/pub/physics/mlclarke/NICE/