抗体の補体媒介性殺菌活性に関する血清殺菌アッセイ

要約

出典:Weerts, H. P., et al. A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay. J. Vis. Exp. (2019).

このビデオは、血清中に存在する抗体の補体媒介性殺菌活性を評価する技術を示しています。このアプローチは、単離された血清を病原性細菌および外因性補体タンパク質と組み合わせます。インキュベーション後、細菌を寒天プレート上で増殖させ、産生されたコロニーを定量して血清殺菌力価を測定します。

プロトコル

1. 補体とターゲット細菌を調製する

1. 赤ちゃんウサギの補遺(BRC)
   を準備します 注:補体ロット選択の詳細な基準は、こちらでご覧いただけます https://www.vaccine.uab.edu/uploads/mdocs/UAB-MOPA.pdf
   1. 冷凍BRCを入手し、流水冷水で解凍します。BRCを完全に解凍するまで、10~20分ごとに物理的に混合します。BRCを凍結融解サイクルにさらさないでください。
   2. BRCの解凍中に、1.5 mL、5 mL、または15 mLの遠心チューブにラベルを付けます。ラベル付きのチューブを氷上に置いて予冷します。予冷した遠心分離管に適切な量のBRCを分注します(充填後、すぐに各チューブを氷に戻します)。アリコートは≤-70°Cで冷凍庫に保管します.
      手記： 各アッセイプレートには約1 mLの補体が必要です。補体アリコートは単回使用用であり、アッセイレイアウトに適した量で分注する必要があります。
   3. 熱不活化BRCを調製するには、活性BRCの1アリコートを解凍します。56°Cのウォーターバスを準備します。BRCが完全に解凍されたら、それをウォーターバスに移し、30分間インキュベートします。
   4. インキュベーション後、熱不活化BRCをウォーターバスから取り出し、室温(RT)で10〜15分間冷却します。アリコートは≤-10°Cで保存してください。
2. 対象菌ストック
   を調製します。 注:以下の手順は、48アリコートの標的細菌ストックを調製するために使用されます。より多くのアリコートが必要な場合は、プロトコルをスケールアップできます。
   1. バクテリアマスターストックバイアルを冷凍庫から取り出し、凍結したバクテリア表面をこすり落とし、バイアルから少量の氷を血液寒天プレートに取り除きます。すぐにマスターストックバイアルを冷凍庫に戻します。
   2. この小さな細菌ストックのアリコートを血液寒天培地プレートに縞模様にし、プレートの蓋で覆います。プレートを逆さまにして、37°C/5%_CO2インキュベーターで一晩インキュベートします。
   3. ~10個の単離された滑らかなコロニーを、30 mLのLBブロスが入った50 mLチューブに移します。培養液の_OD600が~0.6-0.7になるまで、穏やかに振とうしながら37°Cで3〜5時間インキュベー
   トします。
   4. 培養物の上部12.5 mLを回収し、新鮮な50 mLチューブに移します。卓上型マイクロ遠心分離機を使用して、培養物を15,000 x gで2分間遠心分離します。上清を捨て、ペレットを25 mLの15%滅菌グリセロール-LBに再懸濁します。
   5. よく混合し、0.5 mL アリコートを滅菌済みの 1.5 mL 微量遠心チューブ (~48 チューブ) に分注します。アリコートは≤-70°Cで冷凍庫で保存します。
   6. 凝集試験により細菌の同一性を確認した上でご使用ください。
3. 標的菌の最適希釈係数の決定
   注:標的細菌ストックの各バッチは、LBプレート上で~120 CFU/スポットを得るために必要な希釈を決定するために、アッセイ条件で滴定する必要があります。
   1. マイクロタイタープレート(希釈プレート)を用意し、135 μLのAssay Bufferをウェル1Aに加え、120 μLのAssay butterをウェル1B-1Hに加えます。
   2. 凍結した標的細菌のバイアルを冷凍庫から取り出し、室温で解凍します。ウェル1Aに解凍した細菌ストック15ulを加え、細菌ストックを10倍に希釈します。
   3. 30 μLの細菌溶液をウェル1Aからウェル1Bに移し、5倍段階希釈を行います。ウェル1Hまで5倍段階希釈を継続し、合計8希釈(1:10、1:50、1:250、1:1 250、1:6 250、1:31 250、1:156 250、1:781 250)。
   4. 別のマイクロタイタープレート(アッセイプレート)を入手し、アッセイプレートのカラム1および2のすべてのウェルに20 μLのアッセイバッファーを加えます。
   5. 希釈プレートのカラム1の各ウェルから希釈した細菌10 μLをアッセイプレートのカラム1および2の対応するウェルに移します。10 μLの細菌を希釈プレートのウェル1Aからアッセイプレートなどのウェル1Aおよび2Aに移します。
   6. 以下のコントロールAおよびコントロールBの血清殺菌アッセイ(SBA)で説明されているように、ステップ3.6-3.12のアッセイを続行します。
   7. プレートを氷上でインキュベートした後、8つのピペットチップを備えたマルチチャンネルピペットを使用して、カラム1のウェルからLBAプレートに10 μLをスポットします。また、列2からLBAプレートにウェルを見つけます。
   8. 以下のステップ3.14-4.6で説明するように、アッセイを続行します。
   9. コントロールBで~120 CFU/スポットが得られる細菌の希釈値を決定し、この希釈液がアッセイで使用されます。

2. 血清殺菌アッセイ (SBA)

>注:以下に説明する手順は1つのアッセイプレート用ですが、アッセイプレートの数を増やすことができます。

1. 56°Cのウォーターバスでサンプルを30分間インキュベートすることにより、テストサンプルを熱不活化します.
   手記：試験サンプルは、内因性補体活性をなくすために、試験前に熱不活性化する必要があります。これはアッセイの前に行うことができ、不活化されたサンプルは再凍結するか、テストされるまで4°Cで保存できます。
2. アッセイプレートを用意し、20 μLのアッセイバッファーをA行からG行の列1から12列に添加し、20 μLのアッセイバッファーをH行の列1と2列に添加します(表1を参照)。
3. 各試験サンプルの30μLを二重に、アッセイプレートのH列にロードします。例えば、サンプル1の30μLをウェル3Hと4Hに分注し、サンプル2の30μLをウェル5Hと6Hなどに分注します。
4. マルチチャンネルピペットを使用して、試験サンプルの3倍段階希釈を行います。​
   1. ウェル3H-12Hからサンプルの10 μを取り出し、列Gの対応するウェルに移し、サンプルウェルを8〜10回ピペッティングして
   混合します。
   2. 次に、ウェル3G-12Gから10 μを取り出し、列Fの対応するウェルに移してよく混合します。
   3. これらの段階希釈を行Aまで続けます。列Aのウェルを混合した後、ウェル3A-12Aから10μlを取り出して廃棄し、すべてのウェルに20μlが含まれるようにします
      手記：アッセイの総容量80 μLで20 μLの血清が使用されるため、アッセイではさらに4倍の希釈が行われます。この希釈は、血清の希釈に4を掛けることにより、SBA力価の計算中に考慮する必要があります。たとえば、開始希釈率が 1:2 の場合、実際にテストされる希釈率は 1:8 です。
5. 凍結したTarget Bacteria Stockのバイアル1本を取り出し、室温で解凍します。事前に決定された最適な希釈係数に従って、20 mLのアッセイバッファーで細菌を希釈します(この希釈係数はセクション1.3で決定しました)。希釈した細菌10 μLを、マルチチャンネルピペットを使用してアッセイプレートの各ウェルに加えます。
6. 冷凍BRCのバイアル1つと冷凍熱不活化BRCのバイアル1つを取り出し、流水で室温で解凍するか、空気を吹き付けて生物学的安全キャビネットの火格子に置いてすばやく解凍します。
7. 熱不活化BRCの20%溶液を調製します。100 μLの熱不活化BRCと400 μLのAssay Bufferを混合します。この 20% 熱不活化 BRC 溶液 50 μL をカラム 1 のすべてのウェル(コントロール A ウェル)に加えます。
   手記：熱不活化BRCは、アッセイ中の非特異的殺傷(NSK)をモニターするためのコントロールとして使用されます。
8. ネイティブBRCの20%溶液を調製します。1 mLの天然BRCと4 mLのアッセイバッファーを混合します。この混合物をカラム2から12のすべてのウェル(コントロールBおよびテストサンプルウェル)に50 μL加えます。
   手記： 反応混合物中のBRCの最終濃度は12.5%です。
9. プレートシェーカーで10〜15秒間穏やかに振とうしてアッセイプレートを短時間混合するか、マルチチャンネルピペットを使用して8回ピペッティングして混合します。
10. アッセイプレートを37°Cの微生物インキュベーターに2時間(振とうせずに)入れます。
11. 蓋を取り外し、プレートを上向きにして生物学的安全キャビネットに40〜60分間置いて、2枚のLBAプレートを乾燥させます。
12. 2時間のインキュベーションが完了したら、アッセイプレートを湿った氷に移し、10〜20分間インキュベートして反応を停止します。
13. 12チャンネルピペットを使用して、列Hのウェルを混合し、反応混合物のスポットプレート10 μLをLBAプレートの底にスポットプレートします。すぐにプレートを傾け、スポットを~1.5〜2cm動かします。行G、F、およびEに対してこの手順を繰り返し、LBAプレートの前の行の上にある場所を見つけます。行E、F、G、Hは1枚のLBAプレートに、行A、B、C、Dは同じ方法で2枚目のLBAプレートにスポットされています(図1を参照)。
14. LBAプレートを室温でインキュベートし、溶液がLBAプレートに吸着するまで(10〜15分)。LBAプレートに蓋をし、LBAプレートを逆さまにして微生物インキュベーターに置き、一晩(~16-18時間)インキュベートします。Shigella flexneri 2aおよび3aを29°Cでインキュベートし、S. sonneiを26°Cでインキュベートします
    手記：これらの温度は、コロニーカウンター9による正確なカウントに適したサイズの小さな「マイクロコロニー」をもたらす。
15. 一晩インキュベートした後、100 μg/mL TTCと0.1% NaN₃を含む25 mLのOverlay Agar(~55°C)を各LBAプレートに加えます。
16. LBAプレートを37°Cで2時間インキュベートし、生き残った細菌が赤色に成長します(下の図1を参照)。
17. デジタルカメラを使用して写真プレートを作成し、NISTの統合コロニー列挙ソフトウェア(NICE)がインストールされているコンピューターに画像を転送します(図2.
    を参照) 手記：NICEコロニーカウンティングソフトウェアは無料でご利用いただけます。詳細とインストール手順については、マテリアルリストを参照してください。

>表1:アッセイプレートのレイアウト。列 1 と 2 には、補体コントロールウェルが含まれています。コントロールAはカラム1にあり、SBAバッファー、バクテリア、および熱不活化補体を含む熱不活化補体コントロールです。コントロールBはカラム2にあり、SBAバッファー、バクテリア、および補体を含むアクティブ補体コントロールです。カラム3〜12には血清サンプルが含まれています。各サンプルは重複して分析され、行Hから行Aまで3倍に連続希釈されます

名 名 名 名 名

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

ある

コントロールA

コントロールB

希釈率 8

希釈率 8

希釈率 8

希釈率 8

希釈率 8

希釈率 8

希釈率 8

希釈率 8

希釈率 8

希釈率 8

イ

コントロールA

コントロールB

希釈 7

希釈 7

希釈 7

希釈 7

希釈 7

希釈 7

希釈 7

希釈 7

希釈 7

希釈 7

ハ

コントロールA

コントロールB

希釈率 6

希釈率 6

希釈率 6

希釈率 6

希釈率 6

希釈率 6

希釈率 6

希釈率 6

希釈率 6

希釈率 6

ダ

コントロールA

コントロールB

希釈率 5

希釈率 5

希釈率 5

希釈率 5

希釈率 5

希釈率 5

希釈率 5

希釈率 5

希釈率 5

希釈率 5

E

コントロールA

コントロールB

希釈率 4

希釈率 4

希釈率 4

希釈率 4

希釈率 4

希釈率 4

希釈率 4

希釈率 4

希釈率 4

希釈率 4

エフ

コントロールA

コントロールB

希釈率 3

希釈率 3

希釈率 3

希釈率 3

希釈率 3

希釈率 3

希釈率 3

希釈率 3

希釈率 3

希釈率 3

Gさん

コントロールA

コントロールB

希釈率 2

希釈率 2

希釈率 2

希釈率 2

希釈率 2

希釈率 2

希釈率 2

希釈率 2

希釈率 2

希釈率 2

H

コントロールA

コントロールB

希釈率 1

希釈率 1

希釈率 1

希釈率 1

希釈率 1

希釈率 1

希釈率 1

希釈率 1

希釈率 1

希釈率 1

サンプル1

サンプル2

サンプル3

サンプル4

サンプル5

結果

図1:カラーデベロップ後のLBAプレート。代表的なS. flexneri 3a細菌のマイクロコロニーは、一晩で適切なサイズに成長しました。オーバーレイ寒天を添加し、オーバーレイ寒天中のTTC化合物を還元することにより、コロニーが赤色に発達しました。

図2:NISTのIntegrated Colony Enumerator(NICE)ソフトウェアインターフェース。 NICEソフトウェアインターフェースのグラフィカル表現。関心領域(ROI)は、カウントする前に各スポットのコロニーを中心...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ゼラチン	シグマ	G9391	タイプB、粉末、BioReagent、細胞培養に適しています
TTC(2,3,5-トリフェニルテトラゾリウムクロリド)	シグマ	T8877	≥98.0%(高性能液体クロマトグラフィー)
アジ化ナトリウム(NaN3)	シグマ	S2002	≥99.5%
ベビーラビットコンプリメント	ペルフリーズ	31061から3	生後3-4週
Ca2+/Mg2+ の HBSS	インビトゲン	14065-56	フェノールレッドなし
LB寒天(レノックス)	シグマ	L2897	粉末微生物増殖培地
バクト寒天	BDの	214010	粉末、(C12H18O9)n
グリセロール	シグマ	G5516	分子生物学の場合、≥99%
LBブロス(レノックス)	シグマ	L3022	粉末微生物増殖培地
スクエアシャーレ	シグマ	Z617679-240EA	120 mm x 120 mm
アッセイプレート	共演者	3799	蓋付き96ウェルU底プレート
NICEソフトウェア	アラバマ大学バーミンガム校		ftp://ftp.nist.gov/pub/physics/mlclarke/NICE/

の 年 名