腹膜マクロファージによるアポトーシス性胸腺細胞のエフェロサイトーシスの解析

要約

出典: Zhen, Y. et al., マクロファージによるアポトーシス性胸腺細胞包絡の実験的分析. J. Vis. Exp.(2019年)

このビデオは、アポトーシスマウス胸腺細胞の腹膜マクロファージ媒介性エフェロサイトーシスを蛍光顕微鏡で解析する手順を示しています。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

>1. CFSE標識アポトーシス胸腺細胞の作製

1. ナイーブなC57/B6マウス2匹を_CO2吸入で10分間安楽死させ、解剖して胸腔を開き、湾曲した細い先端の鉗子で胸腺を10mLのRPMI1640培地が入った組織培養シャーレに除去(引き抜き)します。
2. 顕微鏡スライドの2つのつや消し端に対して胸腺全体を粉砕し、100 μmのセルストレーナーで懸濁液をろ過することにより、単一細胞懸濁液を取得します。
3. 10 mLの胸腺懸濁液を50 mLチューブに集め、300 x gで5分間遠心分離します。
4. 上清を取り除き、1x PBSの40 mLに再懸濁し、血球計算盤で細胞数をカウントします。
5. 300 x gで5分間遠心分離し、上清を除去します。
6. 50 mLチューブ内の20 mLの1x PBSに、最大2 x 10⁸個の細胞を含む単一細胞懸濁液として再懸濁します(2 x 10⁸個の細胞を超える場合は、残りの細胞を別の50 mLチューブ内の1 x PBSの別の20 mLに再懸濁します)。
7. 40 μL の CFSE ストック溶液 (2.5 mM) を 20 mL の 1x PBS にピペッティングして、別の 50 mL チューブに等量 (20 mL) の 1x PBS に 5 μM の CFSE を入らせ、チューブを 2 〜 3 回反転させてよく混合します。
8. ステップ 1.7 の 20 mL の CFSE をステップ 1.6 の 20 mL の細胞懸濁液に加えます (CFSE の最終濃度は 2.5 μM になりました)
   手記：20 mLの細胞懸濁液ごとに、20 mLのCFSEチューブが必要です。
9. 細胞とCFSE混合物チューブを2〜3回反転させ、混合物を室温で最大2分間暗所でインキュベートし、10mLの熱不活化ウマ血清を加えて反応を停止します。
10. 50 mLチューブ混合物を300 x gで室温で5分間遠心分離します
    手記：CFSEの標識が成功すると、細胞ペレットは淡黄色になります。
11. 上清を取り除き、細胞ペレットを40mLの1x PBSに再懸濁し、血球計算盤で細胞数をカウントします。
12. 細胞懸濁液を300 x gで5分間遠心分離し、上清を廃棄します。
13. 細胞ペレットを40mLのRPMI1640培地で再度洗浄します。
14. 上清を除去し、100 mm組織培養皿にRPMI1640 10 x 10 6細胞/mLの濃度の組織培養培地(RPMI1640、20 mM HEPES、10% FBS(熱不活化)、20 mMグルタミン、および1x Pen/Strep)で細胞を再懸濁します><。 手記： より多くの細胞が得られる場合は、別途100 mmの組織培養皿が必要になります。
15. スタウロスポリンを最終濃度1μMで細胞懸濁液培養に添加し、5%_CO2を添加した組織培養インキュベーターで37°Cで4時間培養します。

2. 腹膜マクロファージの調製

1. 2 匹の C57B6 マウス (またはラボ内の任意の遺伝子操作マウス) に、0 日目に 1 mL の 3% 老化チオグリコール酸を腹腔内に注入します。
2. ステップ1.1と同様に5日目にマウスを安楽死させ、腹部の皮膚を切り開いて皮をむきますが、腹膜はそのままにしておきます。18 G の針に取り付けられた 10 mL シリンジを使用して、10 mL の洗浄バッファー (RPMI1640、2% FBS、0.04% EDTA) を腹腔にすばやく押し込み、腹腔を洗い流します。
3. 同じ針/シリンジで洗浄バッファーをゆっくりと取り出し、洗浄バッファーを50mLチューブに集めます。.
4. 腹膜強制膠液を1x PBSで2回洗浄し、腹膜マクロファージを組織培養培地に2 x 10⁶細胞/mLの密度で再懸濁しRPMI1640 24ウェルプレートの各ウェルに500μLを分注します。プレートを組織培養インキュベーターに2時間放置します。
5. 浮遊細胞を吸引し、500 μLの新鮮な培地と2回交換して、浮遊細胞を除去します。
6. 必要に応じて、図の凡例に示されている濃度でTAM受容体チロシン阻害剤であるRXDX-106をマクロファージ培養の各ウェルに添加し、さらに2時間インキュベートします。

3. 腹膜マクロファージとアポトーシス性胸腺細胞の共培養

1. ステップ1からアポトーシス性胸腺細胞を採取し、培地で3回洗浄RPMI1640。アポトーシス誘導の効率は、この段階でAnnexin V/7-AADキットを使用して測定できます。
2. 実験配置に従って、0 - 12 x 10⁶細胞(500 μL培地中)をプロトコル#2のマクロファージ培養の各ウェルに分配します(例:図1を参照)。これにより、24ウェルプレートの各ウェルで1 mLの全培養量が得られます。アポトーシス性胸腺細胞を添加する直前に、ブロッキング抗体を培養物に添加します。
3. 細胞混合物を37°Cで4時間、5%_CO2を添加した組織培養インキュベーターで培養します。
4. 培養の各ウェルを1x PBS(500 μM EDTAを含む)で2回洗浄し、浮遊アポトーシス細胞を除去します。
5. この段階で、プレート結合マクロファージをCD11b-PEで染色します。
   1. プレート結合マクロファージを染色バッファー(1x PBS、1% BSA)で1回洗浄します。
   2. 2 μL の CD11b-PE を含む 200 μL の染色バッファーを各ウェルに加えます。
   3. プレートを4°Cで20分間インキュベートします。
   4. プレートの各ウェルを染色バッファーで3回洗浄します。
   5. 200 μLの染色バッファーを加え、蛍光顕微鏡下での画像解析のためにプレートを進めます。

結果

図 1.腹膜マクロファージによるアポトーシス性胸腺細胞の食作用の割合。アポトーシス胸腺細胞は、1 μM のスタウロスポリンと 4 時間インキュベートすることにより誘導し、図のパネルに示されている比率でマクロファージ培養物に添加しました。(B)1:1;(C)1:2;(D)1:4;(E)1:6;(F)1:8;(G)1:10;(H)1:12。データはフローサイトメーターで取得しました。食作用性マクロファージの割合は、フローサイトメーターに関連付けられたソフトウェアを使用して分析しました。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Ack溶解バッファー	ギブコ	A10492(英語)
アネキシンV/7-AAD	BDファーミンゲン	559763
抗Mer抗体	R&Dシステム	BAF591
CD11b-PE (クローン M1/70)	BDファーミンゲン	553311
CFSEの	インビトゲン	C1157
DMSOの	シグマ・アルドリッチ	D-2650
EDTA(0.5 mM)	ギブコ	15575-020
FACSチューブ	BDバイオサイエンス	352017
ホースセラム(熱不活化)	インビトゲン	26050088
PBS、1倍	コーニング	21040履歴書
RPMI-1640	コーニング	10040履歴書
RXDX-106	セレックケミカルズ	CEP-40783
スタウロスプリン(100mg)	フィッシャーサイエンティフィック	BP2541-100	100mgに214.3mlのDMSOを加えて、1mMのストック溶液を作ります