方法論記事

マクロファージ細胞外トラップのin vitro刺激と可視化

2025年7月8日

この記事について

要約

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出典:Zhang, Y., et al. In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages. J. Vis. Exp. (2019).

このビデオは、TNF-α、PMA、HOCLなどのさまざまな炎症刺激を使用して、ヒト単球由来マクロファージのマクロファージ細胞外トラップ(MET)のin vitro刺激を示しています。このビデオでは、可視化のためのMETsのSYTOX色素染色の方法も示しています。

プロトコル

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1. HMDMの分極化

  1. 無菌条件下で、インターフェロンγ(IFNγ;20 ng/mL)およびリポ多糖(LPS;1 μg/mL)を完全なRPMI-1640培地に添加して、M1プライミング培地を調製します。完全なRPMI-1640培地にインターロイキン4(IL-4;20 ng/mL)を添加して、M2プライミング培地を調製します。
  2. 無菌条件下で、セクション1で説明したように播種および培養されたヒト単球由来マクロファージ(HMDM)を含む組織培養プレートウェルから培地を吸引します。
  3. 細胞を含むウェルを滅菌PBS(37°Cに予熱)で3回、PBSの1 mLアリコートを使用して慎重に洗浄します。
  4. M1またはM2プライミング培地のいずれかを、HMDMを含む各ウェル(実験に適した方)に1 mL加えます。
  5. 細胞インキュベーター内で5% CO2の存在下で、細胞を37°Cで48時間インキュベートします。

2. HMDMの刺激によるMET放出

誘導
  1. 無菌条件下で、マクロファージ細胞外トラップの異なる刺激物質を含む培養培地を完全なRPMI-1640培地(PMA(25 nM)、ヒト組換えTNFα(25 ng/mL)、またはヒト組換えIL-8(50 ng/mL)に放出するマウスマウス(実験に適した方)を
    2. 調製します。
  2. 次亜塩素酸、HOCl刺激の実験では、細胞に添加する直前に、HBSS(37°Cに予熱)でHOCl(200μM)を調製します。HOClが完全な細胞培地で調製されていないことを確認してください.
    手記：HOClのストック溶液の濃度は、292 nmおよびpH = 116での溶液のUV吸光度を測定し、350 M-1 cm-1の吸光係数を使用して定量化されます。
  3. セクション2で説明した分極処理後、各ウェルから細胞培地を吸引し、37°Cに予熱した滅菌PBS(PMA、TNFα、IL-8用)またはHBSS(HOCl用)のいずれかの1 mLアリコートで細胞を3回慎重に洗浄します。
  4. PMA、TNFα、またはIL-8を用いた実験の場合:最終洗浄ステップでPBSを除去した後、PMA、TNFα、またはIL-8を含む完全培地を1 mL追加します。
  5. TNFαを用いた実験では、細胞インキュベーター内で5% CO2の存在下で細胞を37°Cで6時間インキュベートします。PMAおよびIL-8を用いた実験では、細胞インキュベーター内で5% CO2の存在下で、細胞を37°Cで24時間インキュベートします。
  6. HOClを用いた実験では、最終洗浄ステップでHBSSを除去した後、HBSSに1 mLのHOClを添加します。次に、細胞インキュベーター内で5%CO2の存在下で、細胞を37°Cで15分間インキュベートします。
    1. 細胞上清を慎重に吸引し、ステップ2.3で説明したように、HBSSの1 mLアリコートで細胞を3回洗浄します。
    2. 最終洗浄ステップからHBSSを取り除いた後、1 mLの完全RPMI-1640培地を加えます。次に、細胞インキュベーター内で5%CO2の存在下で、細胞を37°Cで24時間インキュベートします。

3. 生細胞培養におけるMETの可視化

  1. SYTOXグリーン色素をHBSSで40 μMの濃度で調製します。
  2. セクション2で説明したMET放出を誘導する処理の最後に、HMDMを含む各ウェルに25μLの40μMの色素を直接加えます。
  3. 細胞を室温(RT)で暗所で5分間インキュベートします。
  4. HMDMを倒立蛍光顕微鏡の顕微鏡ステージ上の組織培養ウェルに入れてイメージングします。
  5. 顕微鏡の手順
    1. 高解像度カラーデジタルカメラを搭載した広域スペクトル蛍光光源、明視野光源、倒立顕微鏡の電源を入れます(材料の表を参照)。
    2. フィルターホイールを「番号2」の位置に回転させて緑色蛍光(励起= 504 nm、発光= 523 nm)し、組織培養ウェル内に含まれる緑色染色サンプルをイメージングします。
    3. 5倍対物レンズを使用して、顕微鏡の粗い焦点で焦点を合わせ、次に顕微鏡の細かいフォーカスノブで焦点を合わせ、顕微鏡の接眼レンズを通して見たときに画像がシャープでクリアで焦点が合っているように見えるまで
      4. 焦点を合わせます。
    4. 顕微鏡をカメラモードに切り替えます。
    5. 関連付けられたソフトウェアを起動します。
    6. ソフトウェアの[キャプチャ]タブを選択します。
    7. [再生]ボタンをクリックして画像をプレビューし、画像がソフトウェアプレビューウィンドウで鮮明でクリアで焦点が合っているように見えるまで、顕微鏡のファインフォーカスノブを調整します。
    8. キャプチャボタンをクリックします。
      手記： 撮影した画像は、付属のソフトウェアに自動的に表示されます。
    9. ソフトウェア内で、[ファイル] |必要な画像ファイルの種類として保存します。
    10. 顕微鏡で、フィルターホイールを明視野イメージングの「番号5」の位置に回転させ、手順3.5.2〜3.5.9を繰り返して、対応する明視野画像を取得します。
    11. 必要に応じて、手順3.5.2〜3.5.10を繰り返して、その後の画像取得を行います。

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開示事項

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利益相反は宣言されていません。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
120Q広域スペクトル蛍光光源EXFO Photonic Solutions、カナダ、トロントX-CITEシリーズ
Corning CellBINDマルチプルウェルプレート(12ウェル)シグマ・アルドリッチCLS3336細胞培養用
次亜塩素酸(HOCl)シグマ・アルドリッチ320331MET刺激用
インターフェロンガンマサーモフィッシャーPMC4031M1プライミング用
インターロイキン4総合科学RHIL-4M2プライミング用
インターロイキン8ミルテニルバイオテック〒130-093-943MET刺激用
L-グルタミンシグマ・アルドリッチ59202Cさん培地に追加されました
オリンパス IX71 倒立顕微鏡オリンパス、東京、日本
ホルボール12-ミリスチン酸13-アセテート(PMA)シグマ・アルドリッチP8139MET刺激用
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)シグマ・アルドリッチD5652洗濯ステップ用
RPMI-1640 のメディアシグマ・アルドリッチR8758細胞培養用
SYTOXグリーンライフテクノロジーS7020MET可視化用
TH4-200明視野光源オリンパス、東京、日本X-CITEシリーズ
腫瘍壊死因子アルファロンザ300-01A-50MET刺激用
型 シリーズ

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タグ

METSYTOX GreenTNFPMA

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