PMNに対する細菌の細胞外タンパク質媒介性細胞毒性のアッセイ

要約

出典:Dankoff, J. G., et al. ヒト多形核白血球に対する黄色ブドウ球菌の細胞毒性の定量化。 J. Vis. Exp.(2020年)。

このビデオは、病原性細菌である黄色ブドウ球菌が単離されたヒト多形核白血球(PMN)で産生するタンパク質の細胞毒性を調査するアッセイを示しています。分泌された細胞傷害性タンパク質は、PMN細胞膜上に細孔を形成し、細胞死を開始します。ヨウ化プロピジウムを使用して死細胞を染色すると、フローサイトメトリーが行われ、死細胞が定量され、細菌の細胞毒性が評価されます。

プロトコル

人間の福祉に関する制度的、国内的、国際的なガイドラインに準拠して実施され、地元の施設審査委員会によって審査されています。

1. ヒト多形核白血球の精製とヒト血清の単離

>注:すべての試薬は、市販のエンドトキシン検出キットを使用してエンドトキシンの存在を定期的にチェックし、PMNの望ましくないプライミングを防ぐために<25.0 pg/mLのエンドトキシンを含める必要があります。

1. 50 mLの3%デキストラン-0.9% NaCl(w / v)、35 mLの0.9%NaCl(w / v)、20 mLの1.8%NaCl(w / v)、1.077 g / mLの密度勾配溶液12 mL、および20 mLの注射用または灌漑用水を室温に戻します。.
2. ヒト血清を単離するには、抗凝固剤を含まない4 mLの採取したばかりのヒト血液を37°Cで15 mLのガラス管で30分間インキュベートします。インキュベーション後、サンプルを2,000〜3,000 × gで室温で10分間遠心分離します。上部血清層を新鮮な15 mLコニカル遠心チューブに移し、氷上に置きます。
3. 25 mL の新たに採取したヘパリン処理済み(1000 units/mL)全ヒト血と 25 mL の室温 3% デキストラン-0.9% NaCl(1:1 比)を 2 本の反復 50 mL コニカル遠心チューブ (チューブあたり 50 mL の総容量) に組み合わせます。各50 mLコニカルチューブを静かに揺さぶって混合し、室温で30分間放置します。
4. 室温でインキュベートした後、2つの別々の層が現れます。各デキストラン-血液混合物の最上層を新しい50 mLコニカルチューブに移し、450 x gで室温で10分間、ブレーキを低くまたは無くして遠心分離します。
5. 両方の上清を慎重に吸引し、細胞ペレットを乱さずにそれらを廃棄します。各細胞ペレットを室温0.9% NaCl 2 mLに穏やかに再懸濁し、再懸濁したペレットを1本の50 mLコニカルチューブに結合し、残りの0.9% NaCl(最終容量35 mL)を添加します。
6. ハンドピペットを使用して、室温の1.077 g/mL密度グラジエント溶液10 mLを細胞懸濁液の下に慎重に下敷きます。450 x gで室温で30分間、ブレーキを弱めるかブレーキなしで回転させます。細胞ペレットを乱さずに上清を穏やかに吸引します。上清には、前述のように収集できる末梢血単核細胞が含まれます。
7. 赤血球を室温の水20 mLに再懸濁して、赤血球を溶解します。チューブを30秒間揺らして穏やかに混ぜます。赤血球の溶解は、濁度の明確な減少を伴います。
8. 直ちに20mLの1.8%NaCl(室温[RT])を加え、サンプルを450 × gで室温で10分間遠心分離します
   手記：赤血球溶解後にPMNが水中に単独で放置される時間を最小限に抑えることは、PMNの収量を最大化し、PMNの溶解および/または活性化を防ぐために重要です。
9. 細胞ペレットを乱さずに上清を慎重に吸引します。細胞ペレットを 2 mL の RT RPMI 1640 培地に穏やかに再懸濁し、氷上に置きます。
10. 血球計算盤を使用して細胞をカウントします。精製したPMNを1 x 10⁷細胞/mLの濃度で氷冷RPMIで再懸濁し、氷上に保ちます。
11. 精製した PMN 100 μL (1 x 10⁶ 細胞) と 1 μL のヨウ化プロピジウム染色剤を含む 300 μL の氷冷ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) を 2 本のレプリケートフローサイトメトリーチューブで組み合わせます。原形質膜の損傷を確実にコントロールするには、0.5% Triton X-100溶液40 μLをフローサイトメトリーチューブの1つに加え、十分に混合します。
12. フローサイトメトリーを使用して、精製細胞の前方散乱光、側方散乱光、およびヨウ化プロピジウム染色(535/617 nmでの励起/発光最大)を測定します(図1)。
    手記： 前方散乱光および側方散乱光解析により、リンパ球と単球の不要な集団が特定されます。ヨウ化プロピジウムは、損傷した原形質膜を持つ細胞のみを染色し、ヨウ化プロピジウム陽性細胞の集団が顕著である精製されたPMNは使用しないでください。これらの研究では、精製されたPMNは、精製された細胞の>98%で構成され、ヨウ化プロピジウムに対して陽性と染色された<5%の場合にのみ使用されました。
13. このアッセイで使用する個々のウェルに、DPBSで希釈した100 μLの20%単離ヒト血清をコーティングすることにより、PMN細胞毒性アッセイ用の96ウェルプレートを準備します
    手記：プラスチックやガラスに直接PMNをめっきすると、セルが活性化します。メディアのみを受け取るネガティブコントロールウェルを少なくとも1つ、0.05%Triton X-100を受け取るポジティブコントロールウェルを少なくとも1つ必ず含めてください。
14. プレートを37°Cで30分間インキュベートします。インキュベーション後、コーティングされたウェルを氷冷したDPBSで2回洗浄し、余分な血清を取り除きます。プレートを逆さまに軽くたたいて、残留DPBSを取り除き、氷の上に置きます。
15. 100 μLの精製ヒトPMNを1 x 10⁷細胞/mLで各コーティングウェル(1 x 10⁶ PMNs/well)に穏やかに加えます。PMNがウェルに沈殿するのを待つには、プレートを氷上で少なくとも5分間インキュベートします。プレートを水平に保ち、各ウェルに細胞が均一に分布するようにし、PMNの望ましくない活性化を避けるために氷の上に置いておきます。

>2. 黄色ブドウ球菌のヒト多形核白血球に対する細胞毒性試験

1. 黄色ブドウ球菌をトリプシン性大豆ブロス(TSB)で、37°Cに設定した振とうインキュベーターで一晩培養します。これらの研究では、別々の150 mL三角フラスコに20 mLのTSBを、黄色ブドウ球菌株USA300またはUSA300ΔsaeR/Sの凍結培養物に接種し、250 rpmで振とうしながら約14時間増殖しました。
2. 黄色ブドウ球菌を、新鮮な培地で一晩の細菌培養を1:100に希釈することにより、継代培養を行います。37°Cで振とうしながら、細菌が早期の静止増殖段階に達するまでインキュベートします
   手記： これらの実験では、150 mLの三角フラスコに20 mLのトリプシン大豆ブロスを200 μLの一晩培養したUSA300またはUSA300ΔsaeR/Sを接種し、250 rpmで5時間振とうしながら37°Cでインキュベー
トしました。
3. 細菌が初期の静止増殖期に達したら、1 mLの黄色ブドウ球菌を1.5 mLの微量遠心チューブに移し、5,000 × gで室温で5分間遠心分離します。
4. 遠心分離後、上清を3mLシリンジに移します。上清を0.22 μmフィルターに通し、氷上の新しい1.5 mL微量遠心チューブに入れます。
5. 黄色ブドウ球菌の培養に使用した氷冷培地で上清の段階希釈を行います.
   手記： 示された実験では、USA300およびUSA300ΔsaeR/Sの上清を、氷冷TSBで4回連続して1/2 log希釈しました。
6. ステップ1.15から、氷上にPMNを含む96ウェルプレートの個々のウェルに、上清サンプルまたは培地のみ(ネガティブコントロールおよびポジティブコントロール用)を静かに加えます。これらの実験では、10 μL の USA300 または USA300ΔsaeR/S 上清サンプルを各ウェルに添加しました。上清をウェルに分配し、37°Cでインキュベートするために、プレートを穏やかにロックします。
7. 希望の時間に、プレートをインキュベーターから取り出し、氷の上に置きます。0.5% Triton X-100 40 μL をポジティブコントロールウェルに加えます。
8. 各ウェルでサンプルを静かに上下にピペットで動かし、プレートに付着したすべてのPMNを完全に引き抜き、300 μLの氷冷DPBSと1 μLのヨウ化プロピジウムを含む氷上のフローサイトメトリーチューブにサンプルを移します。
9. フローサイトメトリーを使用して、ヨウ化プロピジウム陽性PMNの割合を測定します(図2A)。DNAに結合すると、ヨウ化プロピジウムは535/617nmで励起/発光します。

結果

図1:精製されたPMNのフローサイトメトリー解析。(A)精製されたヒトPMNと(B)末梢血単核細胞で意図的に汚染されたPMNの代表的なフローサイトメトリードットプロット。(C)0.05% Triton X-100(赤陰)で処理したPMN(影付き赤)と比較して、精製済みPMN(影付きグレー)のヨウ化プロピジウム染色が最小限(<1%)であることを示す代表的なフローサイトメトリーヒストグラム。

図2:黄色ブドウ球菌が産生する細胞外タンパク質に中毒状態のPMNのフローサイトメトリー解析。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.9% 塩化ナトリウム注射液、USP、500 mL VIAFLEX プラスチック容器	バクスター	2B1323Q	PMN精製
1.5 mLマイクロ遠心チューブ(スナップキャップ付き)	VWRの	〒89000-044	洗浄セルに使用
1.8%塩化ナトリウム溶液	シグマ・アルドリッチ	S5150	PMN精製
12x75mm培養チューブ	VWRの	60818-430	フローサイトメトリーチューブとして使用
20%(w / w)デキストラン	シグマ・アルドリッチ	D8802	PMN精製
3125ハンドタリーカウンター	トレーサブルな製品	3125CC	細胞のカウント用
50 mLコニカル遠心チューブ	VWRの	89039-656	分注媒体用
バクトトリプシン大豆スープ、大豆カゼイン消化媒体	フィッシャーサイエンティフィック	211823	細胞培養の増殖に
BD ディスポーザブルシリンジ Luer-Lokチップ付き、3 mL	フィッシャーサイエンティフィック	BD 309657	上清のフィルタリング用
Bright-Line血球計算盤	シグマ・アルドリッチ	Z359629	細胞計数装置
DPBS、1x(ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水)、カルシウムおよびマグネシウム	コーニング	21-030-CV	洗浄セルに使用
フィコール・パケ・プラス	GEヘルスケア	17-1440-02	PMN精製
Fisherbrand 滅菌ポリスチレンディスポーザブル血清ピペット	フィッシャーサイエンティフィック	13-678-11E	吸引液用
Greiner CELLSTAR 96ウェルプレート	ミリポアシグマ	M0687	実験サンプル保持プレート
OMICRONシリンジフィルター	オミクロン・サイエンティフィック	SFPV13R	上清のフィルタリング用
ヨウ化プロピジウム	サーモフィッシャーサイエンティフィック	P3566	膜不透過性DNA染色
PYREXブランド4980三角フラスコ	コール・パーマー	EW-34503-24	細胞培養の増殖に
RPMI 1640、1X L-グルタミンなし、フェノールレッド	コーニング	17-105-CV	細胞の再懸濁に使用
灌漑用滅菌水、USP	バクスター	2F7113	PMN精製
ピペットポンプ	ベルアート製品	F37898	吸引液用
トリトンX-100	シグマ・アルドリッチ	X100	メンブレン完全性ポジティブコントロール

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