食作用後の好中球に対する黄色ブドウ球菌株の細胞毒性アッセイ

要約

出典: Dankoff, J. G. et al., Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes. J. Vis. Exp.(2020年)

このビデオでは、フローサイトメトリーを使用して、食作用後のヒト好中球に対する毒性のある黄色ブドウ球菌および毒性の低い黄色ブドウ球菌株の細胞毒性を検出するアッセイを実演しています。

プロトコル

1. 食作用後のヒト多形核白血球に対する黄色ブドウ球菌細胞毒性試験

>注:600 nmでの光学密度(OD600)と細菌の濃度によって定義される成長曲線は、このアッセイを開始する前に試験する黄色ブドウ球菌株について経験的に決定する必要があります。これらの実験を成功させるには、亜培養細菌のOD600を使用して、中指数関数的増殖期に試験した各黄色ブドウ球菌株の等濃度を一貫して収穫する必要があります。

1. 以下に説明するように、黄色ブドウ球菌株および継代培養細菌の一晩培養を開始します。
   1. 黄色ブドウ球菌をトリプシン性大豆ブロス(TSB)で、37°Cに設定した振とうインキュベーターで一晩培養します。これらの研究では、別々の150 mL三角フラスコに20 mLのTSBを黄色ブドウ球菌株USA300またはUSA300ΔsaeR / Sの凍結培養物に接種し、250 rpmで振とうしながら約14時間成長させました。
   2. 黄色ブドウ球菌を、新鮮な培地で一晩の細菌培養を1:100に希釈することにより、継代培養を行います。振とうしながら37°Cでインキュベートします。
2. 1 mLの培養細菌を1.5 mLの微量遠心チューブに移し、5,000 × gで室温で5分間遠心分離することにより、指数関数的増殖が中期に達したときに、亜培養された黄色ブドウ球菌を収穫します><。 手記： 我々の増殖条件下では、USA300およびUSA300ΔsaeR/Sは、約135分間のインキュベーション後に中指数関数的増殖期に達しました。
3. 遠心分離後、上清を吸引し、ペレット化した細菌を1 mLのDPBSに再懸濁し、サンプルを30秒間ボルテックスし、5,000 × gで室温で5分間遠心分離することにより、黄色ブドウ球菌を洗浄します。
4. DPBSで希釈した20%ヒト血清1 mLに細菌ペレットを再懸濁し、37°Cで15分間攪拌しながらインキュベートすることにより、黄色ブドウ球菌をオプソナイズします。
5. オプソニン化細菌を5,000 x gで室温で5分間遠心分離します。遠心分離後、上清を吸引し、ペレット化した細菌を1 mL DPBSに再懸濁し、細菌のペレットが完全にバラバラになるまでサンプルをボルテックスし、さらに30秒間かけて洗浄します。細菌を5,000 × gで室温で5分間遠心分離します。
6. オプソニン化した黄色ブドウ球菌株を1mLのRPMIに再懸濁し、細菌ペレットが完全にバラバラになるまでサンプルをボルテックスし、その後さらに30秒間、細菌を氷上に置きます。
7. オプソニン化黄色ブドウ球菌株を氷冷RPMIで所望の濃度に希釈します。30秒間渦巻き、氷の上に置きます。
8. トリプシン性大豆寒天に細菌の1:10段階希釈液をプレーティングすることにより、オプソニン化黄色ブドウ球菌の濃度を確認します.
   手記：このアッセイで使用される細菌の濃度の違いは、その後のPMN原形質膜の透過性に大きな影響を与える可能性があるため(図1A)、試験する各菌株の濃度は、実験ごとに決定され、菌株間で同等であることが不可欠です。
9. 各黄色ブドウ球菌株またはRPMI(ポジティブおよびネガティブコントロール用)の100 μL/ウェルを、氷上の96ウェルプレートのPMNに穏やかに加えます。ウェルに黄色ブドウ球菌を分布させるための穏やかな岩板。
10. プレートを500 × gで4°Cで8分間遠心分離することにより、食作用を同期させます。遠心分離の直後にプレートを37°Cでインキュベートします(T = 0)。
11. 希望の時間に、プレートをインキュベーターから取り出し、氷の上に置きます。0.5% Triton X-100 40 μL をポジティブコントロールウェルに加えます。
12. 各ウェルでサンプルを静かに上下にピペットで動かし、プレートに付着したすべてのPMNを完全に引き抜き、サンプルを200 μLの氷冷DPBSと1 μLのヨウ化プロピジウムを含む氷上のフローサイトメトリーチューブに移します。
13. フローサイトメトリーを使用して、ヨウ化プロピジウム染色のサンプルを分析します。
14. ヨウ化プロピジウム陽性PMNの割合をフローサイトメトリーで測定します。DNAに結合すると、ヨウ化プロピジウムは535/617nmで励起/発光します。

結果

図1:黄色ブドウ球菌の食作用後のPMNのフローサイトメトリー解析。(A)USA300またはUSA300∆saeR / Sの異なる濃度の食作用の90分後のヨウ化プロピジウム陽性PMNの割合(B)実験に使用されたオプソニン化黄色ブドウ球菌株の濃度はパネルAに示されています。データは、両側t検定によって決定された* p ≤ 0.01の4つの別々の実験の平均±SEMとして示されています。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1.5 mLマイクロ遠心チューブ(スナップキャップ付き)	VWRの	〒89000-044	洗浄セルに使用
12x75mm培養チューブ	VWRの	60818-430	フローサイトメトリーチューブとして使用
50 mLコニカル遠心チューブ	VWRの	89039-656	分注媒体用
バクトトリプシン大豆スープ、大豆カゼイン消化媒体	フィッシャーサイエンティフィック	211823	細胞培養の増殖に
Bright-Line血球計算盤	シグマ・アルドリッチ	Z359629	細胞計数装置
DPBS、1x(ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水)、カルシウムおよびマグネシウム	コーニング	21-030-CV	洗浄セルに使用
フィコール・パケ・プラス	GEヘルスケア	17-1440-02	PMN精製
Fisherbrand 滅菌ポリスチレンディスポーザブル血清ピペット	フィッシャーサイエンティフィック	13-678-11E	吸引液用
Greiner CELLSTAR 96ウェルプレート	ミリポアシグマ	M0687	実験サンプル保持プレート
OMICRONシリンジフィルター	オミクロン・サイエンティフィック	SFPV13R	上清のフィルタリング用
ヨウ化プロピジウム	サーモフィッシャーサイエンティフィック	P3566	膜不透過性DNA染色
PYREXブランド4980三角フラスコ	コール・パーマー	EW-34503-24	細胞培養の増殖に
RPMI 1640、1X L-グルタミンなし、フェノールレッド	コーニング	17-105-CV	細胞の再懸濁に使用
トリトンX-100	シグマ・アルドリッチ	X100	メンブレン完全性ポジティブコントロール

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