細菌感染の In vivo 追跡のためのレポーター酵素蛍光イメージング

要約

出典:Sharan, R., et al. レポーター酵素蛍光を用いたマウスの結核菌のイメージング。J. Vis. Exp.(2018年)。

このビデオでは、結核菌感染のin vivo検出のためのレポーター酵素蛍光(REF)イメージングを実演しています。感染したマウスに、REFイメージング用の基質を腹腔内に注入します。細菌のβ-ラクタマーゼ酵素によって加水分解されると、基質は蛍光を発し、その検出は感染の評価に役立ちます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 菌株と培養条件

>注:この研究では結核菌株CDC1551を使用していますが、どの結核菌株も同じように使用できます。

1. M-OADC-TW(0.5%グリセロール、カタラーゼを含まない10%オレイン酸デキストロース複合体、および0.05%Tween-80を添加した7H9ブロス)培地で、37°Cで37°Cの静置液で、OD₆₀₀が0.5(~0.2 x 10⁷コロニー形成ユニットまたはCFU)になるまで細菌を増殖させます。
2. 培養物をM-OADC-TW(細菌の1:10希釈液のシリーズ)で希釈します。バクテリア(10⁵、10⁶、10⁷、10⁸)の希釈液を選択的7H11プレートに三重にプレートして、CFUの測定を可能にします。
3. プレートを37°Cで4週間、またはコロニーを正確にカウントできるようになるまでインキュベートします。
4. 細菌の接種物を8,534 x gで5分間遠心分離し、ペレットを得ます。ペレットを生理食塩水10 mL(0.9% NaCl)で一度洗浄し、ペレットを生理食塩水15 mL(0.9% NaCl)に再懸濁します。

>2. マディソンチャンバーを用いたマウスのエアロゾル感染

1. マウスが新しい環境に順応するのを1週間待ちます。
2. マウスをチャンバーに入れる前に、マウスの体重を量ります。
3. 電源タップには、メインチャンバーの電源、真空ポンプ、エアコンプレッサーの3本のコードをこの順で差し込みます。
4. ガラス瓶のネジを慎重に緩めます。ガラス瓶をバイオセーフティキャビネットに持って行き、15 mLの生理食塩水(0.9%NaCl)に懸濁したチャレンジ接種物を追加して、肺内の細菌の~10⁴ - 10⁶ CFUを達成します。
5. バイオセーフティキャビネットのガラス瓶の蓋を閉めます。ジャーをネブライザーユニットに取り付け、垂直ステンレス鋼管を調整して、下部(吸気)端がジャー内の流体のレベルから約4分の1インチ下になるようにします。
6. 実験に必要なすべての動物(チャンバーには最大90匹のマウスを収容可能)をチャンバーにロードし、ドアのすべてのラッチを閉じます。
7. メイン(部屋)の空気流量計を確認してください。フロート(ボール)の中心が左側の目盛りで測定したように約50 L / minで動作することを確認します。
8. チャンバーのコントロールパネルにあるスタートボタンを押します。コンプレッサーの空気流量計(左側の小さいメーター)を通る空気流量をスケールで4L / minに設定します。チャレンジ接種物が噴霧されていることを視覚的に確認します。
9. 15分後、コントロールパネルの前面にある赤いライトが表示され、実行の終了を示す音声信号が表示されたら、コントロールパネルの右下隅にあるリセットボタンを押してタイマーをリセットします。
10. チャンバーのドアにある小さな赤いボタンを押し続けると、掃除機が解放されます。
11. チャンバーのドアを開けて、動物を取り出します。マウスをケージに戻します。
12. ガラスネブライザージャーを取り外し、密封された漏れ防止の輸送容器に入れます。容器をバイオセーフティキャビネット内に置き、チャレンジサスペンションを指定された廃棄物容器に捨てます。
13. 使用済みのネブライザージャーをバイオハザードバッグに入れ、オートクレーブに輸送するためにバッグを密封します。
14. 感染手順の最後に、チャンバー内に緩衝フェノールと70%エタノールをスプレーし、チャンバーを10分間放置します。
15. 次に、アクセス可能なすべての内面を非常に完全に拭き取ります。汚染されたペーパータオルなどはすべて廃棄してください。バイオハザードのゴミ箱に。ゴミ、廃容器、使用済みのネブライザージャーをオートクレーブします。
16. 動物を撮影時点まで収容室に戻します。
17. イメージング当日は、セカンダリコンテナに入った動物をイメージングルームに移します。

3. 動物の麻酔

1. カスタマイズされたガス麻酔システムを使用して、マウスをイソフルランで麻酔します。
2. 麻酔ユニットの上部にある2つのチャコールフィルターキャニスターのそれぞれを計量します。
3. 重量が初期重量より 50 g 大きい場合は、新しいキャニスターと交換します。
4. 気化器ユニットをチェックして、手順に十分なイソフルランを確認します。
5. ノーズコーンホルダーをイメージングチャンバー内に置きます。手順に必要な数のノーズコーンを配置し、残りの開口部をノーズコーンブロッカーで密封します。
6. 高圧ボンベからの酸素供給をオンにし、55psiに設定します。
7. 麻酔器の前にある排気ポンプをONにし、8L/minに設定します。
8. 麻酔ユニットの前にある酸素トグルをオンにします。
9. 麻酔誘導室へのガスの流れをONにして、ガスの流れを1.5L/minに設定します。
10. イメージングチャンバーへのガスの流れをONにして、ガスの流れを0.25L/minに設定し、ガスの流れをオフ
にしてください。
11. イソフルラン気化器の電源を入れ、2〜2.5%に設定します。イソフルラン気化器のダイヤルを回して、実験に使用する動物の数と体重に応じてイソフルランレベルを調整します(体重~20gのマウスの場合は2〜2.5%、体重300gのモルモットの場合は4%)。
12. マウスを麻酔チャンバーに入れ、蓋を閉めます。麻酔誘導室へのガスの流れをオンにします。
13. マウスを麻酔導入チャンバーに5〜10分間放置し、完全に麻酔します。
14. マウスに麻酔をかけたら、イメージング中に眼を保護するために光学軟膏を塗布します。
15. マウスを腹側または胸骨の横臥位にして、鼻が鼻円錐に配置されるようにして、イメージング手順中のマウスの麻酔を容易にします。

4. レポーター酵素蛍光(REF)イメージング

1. 腹腔内注射により基質(20μM、重量2.5μL / g)を感染マウスおよび対照マウスに注入します。.マウスは、イメージングチャンバー内で1分未満麻酔下にあります。
2. イメージングシステムを起動します。
3. [初期化]をクリックしてシステムを初期化します。温度バーが緑色に変わるまで待ちます。
   手記： イメージングチャンバーは、イメージング中に動物の体温を維持するための加熱プラットフォームで構成されています。
4. イメージング取得設定では、Fluorescent |動物全体のトランスイルミネーション、または肺組織、構造、および取得コントロールパネルのオーバーレイ用のエピイルミネーション。
5. 1 つのマウスの視野を B に設定し、ランプ レベルを高に設定します。
6. 露光時間をオート、ミディアムビニング、f /ストップの2〜3、745 nmの励起フィルター、780 nm〜840 nmの発光フィルターに設定します。
7. シーケンス設定には、Sequence Setupをクリックし、肺領域の9〜12のトランス照明ポイントを選択します。
8. 画像取得のために Acquire をクリックします。
9. イメージング後にマウスをケージに戻します。
10. マウスが完全に回復するまでモニターするか、実験の時点でイメージングする場合はCFUの定量化のためにマウスを犠牲にします。修正されたカルノフスキースコアを実行して、イメージング後のマウスの健康状態を監視します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
イソフルラン	ベトン	501027
CNIR800	カスタム合成
Fatal Plusソリューション	ボルテックファーマシューティカルLs、Ltd
7H9ミドルブルックブロス	BDの	271310
OADCミドルブルックエンリッチメント	BDの	212351
スポルシジン		RE-1284F
7H11ミドルブルック寒天	BDの	212203
マディソン商工会議所
IVISスペクトラム	パーキン・エルマー	124262
XGI-8-ガス麻酔システム	パーキン・エルマー
リビングイメージングソフトウェア	パーキン・エルマー
透明なノーズコーン	パーキン・エルマー
結核菌 CDC1551	ATCCの
雌のBALB/Cマウス、5-7週間	ジャクソン研究所