動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
1. 骨髄由来マクロファージ(BMM)の単離と分化
- 0日目:CO2チャンバーで4〜6週齢の雌C57BL / 6またはBALB / cマウスを犠牲にし、子宮頸部脱臼による死亡を確認します。はさみや鉗子を70%エタノールに浸したままにして、滅菌を確実にします。手袋に70%エタノールをスプレーして、骨髄細胞の分離プロセス全体で無菌状態での取り扱いを可能にします。
- 犠牲にされたマウスを解剖板に固定するには、前肢をピンで固定し、70%エタノールを大量に噴霧して消毒します。
- 股関節付近にハサミで小さく切開(約1cm)します。ハサミを皮下に丁寧に挿入して、下にある筋肉を分離し、股関節の周りの皮膚を切ります><。
手記：解剖ボードは、股関節へのアクセスを改善するために回転させることができます。
- 足首に向かって引っ張って取り除くことにより、脚から慎重に手袋をはがした皮膚を取り除きます。足首で足を切り落とし、脛骨が完全に無傷のままになるように、足首の関節またはその下を切るように細心の注意を払います。
手記：この段階の腓骨は緩く取り付けられているため、鉗子で簡単に分離できます。
- 大腿骨を操作して股関節を手動で位置特定し、回転点を特定します。はさみを慎重に使用して股関節の上の脚を切断し、大腿骨の近位頭を無傷のままにします。
- ハサミで脚からできるだけ多くの筋肉と結合組織を取り除きます。足首に残っている皮膚と股関節の上の余分な骨材を取り除きます。
- 洗浄した脚の骨を、ペニシリン/ストレプトマイシン(最終濃度1%)を添加した滅菌済みのロズウェルパーク記念研究所RPMIに、氷上のペトリ皿に入れます。
- 手順1.4から1.6を繰り返して、脛骨と大腿骨をもう一方の後肢から分離します。
- 滅菌された鉗子と滅菌された#10ブレードを使用して、RPMIに浸した骨から残っている筋肉と結合組織をすべて取り除きます。
- ペトリ皿の蓋に骨を置きます。足首の関節のすぐ上にあるブレードで脛骨を慎重に切り、骨髄にアクセスします。膝関節のすぐ下を切って、脚の残りの部分から脛骨を取り除きます。
- ペニシリン/ストレプトマイシン(最終濃度1%)を添加した10mLの滅菌RPMIを10mLシリンジに引き込み、25Gの針を取り付けます。
- 鉗子で脛骨を氷上の50mLの円錐形チューブの上に垂直にしっかりと保持します。シリンジを使用して、骨の端に約5 mL RPMIを静かに注入し、骨髄をもう一方の端から円錐管に洗い流します。骨が白くなるまで、合計10 mL RPMIで骨髄を洗い流します。
手記：徹底的に洗い流した後、骨は白くなるはずです。そうでない場合は、フラッシングを続けて骨髄を取り除きます。脛骨の遠位端が狭すぎて針を挿入できない場合は、ブレードで切り戻す必要がある場合があります。
- 膝関節のすぐ上と股関節のすぐ下にある大腿骨を切開して骨の両端を露出させ、骨髄にアクセスします。脛骨と同じ方法で、合計10mLのRPMIで大腿骨から骨髄を洗い流します。
- 残りの骨で手順1.6から1.13の洗浄とフラッシングを繰り返し、骨髄で洗い流された細胞を単一の50 mLコニカルチューブ
に収集します。
手記：骨がフラッシングする前に解剖中に骨が折れた場合は、この骨の骨髄を使用しないでください。
- 4つの骨すべてから洗い流された骨髄を採取するために使用した円錐管を、4°C、300 x gで10分間遠心分離します。
- 最終濃度が20%のウシ胎児血清、FBS、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、1.2 mMナトリウムピルビン酸、25 μg/mLのヒトマクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)を含む滅菌BMM培地(RPMI)60 mLを、フィルターキャップ付き175 cm2細胞培養フラスコに入れます。
- 遠心分離後に上清を捨て、フラスコから5 mLのBMM培地を使用して穏やかに上下にピペッティングして細胞ペレットを再懸濁します。
- 細胞懸濁液を培養フラスコに移し、培養フラスコのBMM培地でコニカルチューブを2回すすぎ、細胞の回収率を最大限に高めます。細胞懸濁液が培地に完全に混合されていることを確認し、最初の175 cm2細胞培養フラスコから30 mLをフィルターキャップ付きの2番目の175 cm2細胞培養フラスコに分配します。
- 30 mLの細胞懸濁液を含む両方のフラスコを37°C、5%二酸化炭素(CO2)で一晩ごとにインキュベートし、汚染された線維芽細胞、常在マクロファージ、およびその他の接着細胞を分離できるようにします。
- 1日目:フラスコから未分化骨髄細胞を含む上清を100 mm x 15 mmの非TC処理ポリスチレンペトリ皿に約10 mL /皿で移し、37°C、5%CO2でインキュベートします。フラスコを捨てます。
- 3日目または4日目:各シャーレに5 mLのBMM培地(37°Cに予熱)を追加し、37°C、5%CO2でのインキュベーションを続けます。
2. 感染のためのカバースリップへのBMMのメッキ (DAY 7 or 8)
- 各空のウェルの底に4枚の滅菌12 mmガラスカバースリップ(オートクレーブ滅菌済みで密閉ガラス容器に保存)を4枚入れて、6ウェル組織培養プレートを調製します。
手記：滅菌済みの12mmカバースリップを、吸引チップを真空ラインに取り付けて持ち上げます。カバースリップを重ならないようにウェルに配置し、チューブをつまんで真空を中断することにより、希望の位置でカバースリップ を解放します。
- 接着性骨髄由来マクロファージでコーティングしたペトリ皿から培地(および非接着性細胞)を吸引し、付着細胞をカルシウムおよび塩化マグネシウムを含まない滅菌ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(PBS-/-)で2回穏やかにすすぎます。
- 最終濃度1 mMのエチレンジアミン四酢酸(EDTA)の滅菌済み1x PBS/-を5 mLの滅菌済み1x PBS/-を各シャーレに滴下し、37°Cで5分間インキュベートして付着BMMを剥離します。
- 1x PBS-/-に懸濁したすべての分離細胞を、1 mM EDTAを添加した50 mLコニカルチューブに回収します。各ディッシュを5 mLのPBS-/-で2回すすぎ、細胞懸濁液プールに加えます。
手記：細胞懸濁液は、収集プロセス中にマクロファージをEDTA毒性から保護するために、追加のPBS-/-で希釈することができます。
- 300 x gで4°Cで10分間遠心分離し、上清を捨て、ピペッティングによりマクロファージを5〜10 mLのBMM培地に再懸濁します。再懸濁した細胞を氷の上に置いて、チューブへの付着や凝集を防ぎます。
- 血球計算盤でトリパンブルー排除を使用して生存細胞をカウントします.
手記：5 mL培地に再懸濁したBMM細胞をカウントするには、445 μL PBS/-と30 μL 0.4% Trypan blue溶液に25 μLの細胞懸濁液を希釈ミックスすると、通常、血球計算盤で容易に定量できます(最終計算では20倍の希釈係数を考慮に入れます)。トリパンブルーで染色されなかった細胞(生細胞)のみをカウントします。この混合物が過度に濃縮または希釈されている場合、細胞懸濁液の量が変化する可能性があります。一般に、調製物当たりのBMMの収量は、1匹のマウスから2 x 107から5 x 107細胞の間で変動します。
- BMM培地中の細胞懸濁液を所望のプレーティング濃度(5 x 105/mL)で調製し、懸濁液をウェルあたり2 mL培地中の6ウェルプレートに分散させて、各ウェルが1 x 106マクロファージを受け取るようにします
手記：これは、すべてのウェルがカバーガラスを均一に覆うのに十分な数のマクロファージを確実に得るための重要なステップです。ウェルのカバースリップが媒体に重なったり浮いたりしていないことを確認してください。その場合は、滅菌ピペットチップで優しく調整します。
- 37°C、5%CO2で一晩インキュベートします。
>3. リーシュマニア・アマゾネンシスの感染型精製
>注:Leishmaniaの感染症に備える-静止した前胸茎の培養物からメタ環状前胸茎を精製するか、または標準的なL. amazonensisaxenic分化プロトコルを使用して培養中の前胸茎をアマスチゴートの形態に分化します。
- 密度勾配培地を用いたリーシュマニアメタ環状前胸茎類の精製(材料)
- 密度勾配培地の40%ストック溶液を、エンドトキシンを含まない滅菌水で調製します。
- 密度勾配溶液を 10x M199 培地(血清なし)で希釈し、M199 培地に 10% の濃度を調製します。
- 0.22 μmフィルターですべての溶液をろ過します。
手記：ストック溶液は、暗闇の中で4°Cで1ヶ月以内に保存できます。
- 15 mL のコニカル遠心チューブの底に 2 mL の 40% 密度グラジエント培地溶液を加えます。
- 40%密度グラジエント培地層の上にM199の10%密度グラジエント培地溶液2 mLを2 mL重ね、パスツールピペットを使用して2つの層が混ざらないように慎重に行います。
- 固定相培養液から1 x 109寄生虫を1,900 x gで10分間遠心分離して収集します。
- 細胞を6 mLのダルベッコ改変エッセンシャル培地(DMEM)に再懸濁します。
- 細胞懸濁液の2 mLを10%密度グラジエント培地層の真上に、パスツールピペットを使用して穏やかに層間の混合を避けます。
- グラジエントを室温で1,300 x gで10分間遠心分離します
手記：リーシュマニア種間の物理的特性の違いにより、最大の収量を確保するためには、それぞれの遠心分離条件をわずかに調整する必要があるかもしれません。
- 上部10%密度勾配培地境界(0%と10%の密度勾配培地層の間の界面)に形成されたバンドから寄生虫(メタサイクリック前乳房型に富
む)を収集します。
- 寄生虫を1容量のDMEMで希釈し、遠心分離(室温で1,900 x gで10分間)で回収します。
- 500 μL DMEM培地に再懸濁し、血球計算盤でカウントして収量を定量化します。
- 無軸培養条件下でのL. amazonensis amastigotesの作出(低pH/高温)
- 5 mLの対数期前長茎培養物(pH 7.4、26°C)と等量のアマスチゴート培地(pH 4.5)を、25 cm2フラスコ(合計10 mL培地)を使用して混合し、26°Cで一晩インキュベートします。
- フラスコを26°Cから32°Cにシフトします。
- 3〜4日後、アマスチゴート培地で32°Cで1:5に培養を分割します。
- 次の3〜4日間(最大7日間)で寄生虫をチェックして、感染症に使用する準備ができているかどうかを確認します。
手記：健康な無菌性無菌は、目に見えるべん毛のない楕円形をしている必要があります。部分的に分化したアマスチゴテスは、短いべん毛を持つ大きな楕円形をしています。文化は多くの塊を持つべきではありません - 多くの塊は成長していない、死にかけている寄生虫の兆候です。アマスティゴートの培養物は1:5に分割し、最大3週間維持することができます。
4. L. amazonensisの感染
- 寄生虫懸濁液を所望の感染の多様性(MOI)に従って希釈します(通常、マクロファージあたり3〜5個のメタサイクリック前mastigotes[MOI 1:3または1:5]、マクロファージあたり1個のアマスチゴート[MOI 1:1])。すでに2 mLの培地が含まれている各ウェルに、PBS中のLeishmaniaを50〜100 μLの容量で加えます。
- BMMをアマスチゴテスと1時間、メタサイクリック前mastigotesと3時間、34°Cでインキュベートして感染させます。
手記：最適な感染温度は種によって異なる場合があります。
- インキュベーション後、各ウェル内の遊離寄生虫を3回、37°Cに予熱した2mLのPBS-/-で完全に洗い流します。
手記：PBSを穏やかに分散させて、カバーガラスが互いに浮かばないようにします。プレートを静かに回転させてから、液体を吸引します。複数の寄生虫株を使用する場合は、相互汚染を避けるために別の吸引チップを使用してください。
- 各ウェルを1.5 - 2% PFAのPBS中2% PFAと10分間インキュベートし、1時間または3時間の時点のサンプルを固定します。PBSのカバースリップを含むプレートを最後に洗浄して冷蔵し、染色するまで
冷蔵しないでください。
- 2 mLの新鮮なBMM培地をプレート上の各ウェルに加え、さらにタイムポイントを取得し、34°Cでインキュベートします。
- ステップ4.3で説明したように、残りの時間点を必要に応じて固定し、染色するまでプレートを冷蔵します。
>5. 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 染色とカバースリップの取り付け
- カバーガラスを含むウェルからPBSを吸引し、1.5 mLのPBS-/-を0.1%非イオン性界面活性剤とともに加えます。室温で10分間インキュベートした後、2 mLのPBS-/-で3回洗浄します。
- カバースリップを含むウェルに、1 mLのPBS/--と2 μg/mL DAPI(5 mg/mLの水溶液から希釈)を加え、室温でさらに1時間インキュベートします
手記：DAPIによるインキュベーション時間は、細胞内リーシュマニア原虫を適切に可視化するために重要です。マクロファージの核は、サイズが大きく、デオキシリボ核酸(DNA)含有量が高いため、急速に染色されますが、細胞内寄生虫の核の染色は遅くなります。したがって、DAPIが寄生虫の原形質膜と寄生虫の核膜を透過できるようにするためには、BMM核を可視化するために必要な時間を超えてインキュベーション時間を延長する必要があります。適切なDAPI染色により、核DNAに加えて、寄生虫のべん毛ポケット近くのミトコンドリアキネトプラストDNAも可視化できます。
- カバースリップを含む各ウェルを2 mL PBSで3回洗浄し、カバースリップを鉗子で持ち上げて裏返し、細胞側を下にして、市販の退色防止剤を塗布したガラス顕微鏡スライドにマウントします。
手記：カバーガラスは非常に壊れやすいため、取り扱いには注意が必要です。持ち上げるときは、特にウェルの側壁に対して圧力をかけないでください。PBSを数滴加えると、カバースリップとウェルの間の表面張力が低下し、吊り上げプロセスが容易になります。ファインゲージの針を使用して、ウェルの底からカバースリップをこじ開けるのを助けることができます。スライドにカバースリップを載せた後、鉗子で優しく押し下げ、封入剤中の気泡を押し出します。持ち上げプロセス中にカバースリップが壊れたり、裏返ったりした場合は、再度取り付けないでください。予備の4枚目のカバースリップを使用するだけです。
- スライドを定量化まで冷蔵します。
6. 感染の定量化
- 100倍対物レンズと液浸油(358 nmで励起、461 nmで最適発光)を含ませたマクロファージに焦点をあて、蛍光顕微鏡下でDAPI染色スライドを検査します。
スライドガラスとカバーガラスの間のマクロファージの層に焦点が当てられていることを確認してください。
- マクロファージ(DAPIで染色された大きな核)の数と、各視野の各マクロファージ核の周りに集まっている小さなアマスチゴート核の数(図1A、DAPIを参照)を、手動カウンターを使用して定量化します。
手記：Amastigoteの核は、サイズが小さいため、すべてが1つの焦点面に見えるとは限りません。マクロファージ核に焦点を合わせたときに見えるものを数え、ファインフォーカスを使用してマクロファージ核の上下の平面に寄生虫核がないか確認します。
- 別の視野に移動して、定量化を繰り返します。別のカウンター キーを使用して、カウントされたフィールドの数を追跡します。カウントの重なりを防ぐために、各カバースリップを横切って平行な列で視覚フィールド内を移動します。
- カバーガラスあたり最低200のマクロファージを定量します。感染の各時点を3倍(3枚のカバースリップ)で定量化します。前のカバースリップのいずれかがカバースリップの重なり、取り付け不良、ガラスの破損などの理由でカウントに適さない場合は、4番目のカバースリップをカウントします<br />
手記：1枚のカバースリップで200個のマクロファージを数えられない場合は、予備の4枚目を数えます。
- amastigotes/macrophageまたはamastigotes/100マクロファージとして感染率を計算し、生の定量データから感染したマクロファージの割合を決定します。
