$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. オルガノイド培養の経過
- ウェル内の地下マトリックスに1mlの冷たい基礎培地を加えます。1mlのマイクロピペットを使用して、地下マトリックスが壊れるまで激しく上下にピペットします。15mlチューブに移します。氷の上に置きます。
- オルガノイドをピペットに取り、10回上下に激しくピペットで動かします。オルガノイドの破壊は目で観察できます。
>2. オルガノイド培養のマイクロインジェクション。
>注:このプロトコルは、オルガノイドに細菌をマイクロインジェクションするために使用できます。マイクロインジェクションに対してより寛容なオルガノイドで注入を開始すると役立つ場合があります。例えば、マウスの胃オルガノイドは、標的にしやすい非常に大きな嚢胞性オルガノイドに成長することができます。
- 材料の準備
- メーカーの推奨に従って、マイクロピペットプーラーを使用してガラスキャピラリーを2本の注射針に引き込みます。マイクロピペットプーラーは、ガラスキャピラリーの中央で加熱し、キャピラリーを2つの部分に引っ張ることで、2本のガラス針を生成します。いくつかの針を引っ張って、きれいなシャーレに保管するのが実用的です。
- 細菌感染を可能にするには、少なくとも3回の培地交換(= 1週間)の間、すべての培地から抗生物質を取り除きます。これにより、地下マトリックスから抗生物質が希釈されます。特定の抗生物質に耐性のある細菌株を使用している場合は、汚染の可能性を最小限に抑えるために、この特定の抗生物質を追加してください。
- マイクロインジェクション用のワークベンチを準備します。さまざまなバイオセーフティレベルでの作業では、無菌ベンチ内に実体顕微鏡を配置する必要がある場合があります。このプロトコルでは、バイオセーフティレベル2の条件下で、無菌ベンチ内の実体顕微鏡下でピロリ菌を注入します。
- 標準的なプロトコルに従って細菌を培養します。
- 感染の多様性(MOI)を推定するには、以下に概説するように、細菌の数とオルガノイドあたりの細胞数の2つのパラメーターを推定します。MOIは、例えば宿主のIL-8 mRNA発現などの結果と相関させることができます。
- 感染溶液中の細菌密度を計算するには、まず、標準プロトコルに従って光学密度とコロニー形成単位(CFU)の標準曲線を確立します。550 nm で 0.1 の光学密度は、約 107 CFU/ml になります。
- オルガノイドあたりの細胞数を推定するには、1ウェルのオルガノイドの数を数えます。手順1.1-1.4で概説したようにオルガノイドを破壊します。200 x g、4°Cで5分間遠心分離した後、1 mLの酵素解離溶液を加えて再懸濁します。
- 37°Cで5〜10分間振とうを繰り返しながらインキュベートし、顕微鏡(Leica DMILなどの10倍倍率の倒立顕微鏡)で細胞が単一細胞に解離したかどうかを確認します。必要に応じてインキュベーションを延長します。
- 血球計算盤を使用してオルガノイドあたりの細胞をカウントし、オルガノイドあたりの細胞数を計算します。直径約200μmのヒト胃オルガノイドには、約4,000個の細胞があります。0.2 μlのバクテリア溶液に1 x 109 バクテリア/mLを注入すると、MOIは約50になります。
- オルガノイドの注入。
注:マイクロインジェクションの場合、ガラス針はホルダー内で安定しており、マイクロマニピュレーターで3次元に操作できます。オルガノイドは、ウェル内の地下マトリックス内に留まります。ウェル内のサイズと位置により、すべてのオルガノイドが等しく注入に適しているわけではありません。通常、1つのウェル内の30の最大のオルガノイドは、5分で標的にすることができます。
- バクテリアを採取し、標準的なプロトコルに従って基礎培地で洗浄します。
- 光学密度に従って ml あたりの細菌の数を計算します (ステップ 2.1.5.1 を参照)。基礎培地でバクテリアを1 x 10 9 バクテリア/mlに希釈します。
- ガラスの針を取ります。鉗子を使用して、開口部の幅が約10μmになるように先端を壊します。
- 注射針を注入ホルダーに挿入し、マイクロマニピュレーターに固定します。
- 約10μlの細菌溶液を針に取り込んでください。
- オルガノイド培養物を含むローエッジの4ウェルプレートを実体顕微鏡下に置きます。
- マイクロマニピュレーターでナビゲートし、針で単一のオルガノイドを標的にします。針をオルガノイドの近くに置き、素早い動きで針をオルガノイドに挿入します。マイクロインジェクターを使用して、各オルガノイドに約0.2μlの細菌溶液を注入します。
3. 任意の分析のためにオルガノイドを収穫します。
- 例えば、4時間後にオルガノイドを固定します。上清を取り除き、2%ホルムアルデヒド1 mLを加え、室温またはO/Nで4°Cで20分間インキュベートします。オルガノイドは、標準的な手順に従って免疫組織化学を処理できます。