真核細胞内のCoxiella変異体の細胞内増殖の評価

要約

出典:Martinez, E. et al., Coxiella burnetiiトランスポゾン変異体の生成およびマルチ表現型ハイコンテントスクリーニング.J. Vis. Exp.(2015年)

このビデオは、培養上皮細胞内のGFPタグ付きCoxiella変異体の細胞内増殖を評価する方法を示しています。変異体の表現型は、免疫染色および脱視顕微鏡を用いて可視化され、細胞内増殖に対する変異の影響を研究することができます。

プロトコル

1. 緑色蛍光タンパク質GFPタグ付きCoxiellaトランスポゾン変異体ライブラリーの生成

Coxiella burnetii RSA439 NMIIをバイオセーフティ封じ込めレベル2(BSL-2)で、地域の規則に準拠して微生物安全キャビネット(MSC)で操作します。使用した細菌モデルと互換性がある場合は、1.4.1 から 1.4.4 までの手順を繰り返して、クローン変異体を取得する確率を高めます。典型的な変異体ライブラリーは、(少なくとも)使用される生物のゲノムにアノテーションされたコード配列の数の3倍に等しい多数の変異体で構成されています。

1. エレクトロコンピテントCoxiella RSA439 NMIIの調製:
   1. 1x 酸性化クエン酸システイン培地-2 (ACCM-2) を調製します: 13.4 mM クエン酸、16.1 mM クエン酸ナトリウム、3.67 mM リン酸カリウム、1 mM 塩化マグネシウム、0.02 mM 塩化カルシウム、0.01 mM 硫酸鉄、125.4 mM 塩化ナトリウム、1.5 mM L-システイン、0.1 g/L バクトネオペプトン、2.5 g/L カサミノ酸、1 g/L メチルベータシクロデキストリン、125 ml/L ロズウェルパーク記念研究所 (RPMI)。pHを4.75に調整し、フィルター滅菌します(オートクレーブしないでください).
      手記：液体ACCM-2は、4°Cで約1ヶ月間安定です。
   2. 100 mLのACCM-2に2 x 10⁶ゲノム相当(GE)/mLのCoxiella RSA439 NMII(ステップ1.5のように以前に生成および定量化された細菌ストックから)を-80°Cストックから接種し、細菌懸濁液をベントキャップ付き75 cm²細胞培養フラスコ(フラスコあたり10〜15 mlの細菌懸濁液)に分配します。5%の二酸化炭素(CO₂)と2.5%の酸素(O₂)の加湿雰囲気で37°Cで7日間成長させます。
   3. 得られた細菌懸濁液を50 mLチューブにプールし、3,900 x gで4°Cで1時間遠心分離します。
   4. 上清を捨て、ペレットを30mlの10%グリセロールに再懸濁します。3,900 x gで4°Cで1時間遠心分離します。
   5. ペレットを適切な容量の10%グリセロール (通常は2 mL) に再懸濁し、500 μLのチューブに50 μLを分注します。全過程で再懸濁したバクテリアを氷上に保管してください.
      手記：この段階では、細菌はエレクトロコンピテントであり、1回のエレクトロポレーションを行うには1つのアリコートで十分です。細菌懸濁液は、-80°Cで6ヶ月間保存することも、プラスミドデオキシリボ核酸(DNA)のエレクトロポレーションに直接使用することもできます。
2. トランスポゾンおよびトランスポザーゼをコードするプラスミドによるコンピテントCoxiellaのエレクトロポレーション:
   1. 0.1cmのエレクトロポレーションキュベットを氷上で10分間予冷します。50 μlのエレクトロコンピテントCoxiellaを10 μgのトランスポゾンプラスミドおよび10 μgのトランスポゼースプラスミドと混合します。グリセロールの希釈を最小限に抑えるために、プラスミド濃度が500 μg/mlより高いことを確認してください。
   2. 18 kV、500 Ω、25 μF のセットアップを使用してエレクトロポレートします。結果として得られる時定数が 9 から 13 ミリ秒の間であることを確認してください。
   3. 直ちに950μlのRPMIを添加し、エレクトロポレーションした細菌を再懸濁してスクリューキャップチューブに移し、室温で保存してください。
   4. エレクトロポレーションしたバクテリア200 μlを取り込み、1%熱不活化ウシ胎児血清 (FBS) を添加したACCM-2 3 mLを6ウェルプレートに加えます。エレクトロポレーション細菌の残量に88 μlのジメチルスルホキシド (DMSO) を加え (最終濃度10% DMSOに)、-80 °Cで保存します< br /> 注:以下のプロトコルでは、トランスポーザブルエレメントとトランスポゼースは、2つの異なるプラスミド(それぞれpITR-CAT-GFPおよびpUC19-Himar1C9)によってコードされます。どちらのプラスミドもCoxiella特異的な複製起点を欠いているため、Coxiellaでエレクトロポレーションすると自殺的なプラスミドになります。これにより、安定したトランスポゾン挿入が保証されます。転置可能なエレメントは、選択のためにCoxiellaプロモーターp1169の調節下にあるクロラムフェニコール耐性カセットを含み、生成された変異体にGFPをタグ付けするためのCoxiellaプロモーターp311の調節下にあるgfp遺伝子を含んでいます。
3. トランスポゾン変異体の選択:
   1. 上記のように接種した6ウェルプレート(1.2.4)を、5%_CO2および2.5%_O2の加湿雰囲気下で37°Cで一晩インキュベートします。適切な抗生物質(375 μg/mlカナマイシンまたは3 μg/mlクロラムフェニコール)を添加します。上記の条件でさらに3日間、細菌培養物をインキュベートします。
4. 個々の変異体の単離:
   1. Coxiellaトランスポゾン変異体の固体ACCM-2プレートの調製とプレーティング
      手記：次の手順は1つのペトリ皿用であり、コロニー分離の最適な接種量を評価するために、細菌培養物のいくつかの希釈をテストする必要があります。
      1. 0.5%アガロース10.5mlを電子レンジで加熱し、55°Cのウォーターバスで冷まします。11.25 mlの2x ACCM-2(pH 4.75)を37°Cで加熱します。
      2. ボトムアガロースを準備します。
         1. 溶かした0.5%アガロース10 mLを2x ACCM-2 10 mLと混合し、適切な抗生物質(カナマイシン375 μg/mlまたはクロラムフェニコール3 μg/ml)を加えます。
         2. すぐにペトリ皿に注ぎます。ペトリ皿を蓋を外し、中皿を30分間冷まし、20分間風乾させます。
      3. トップアガロースを準備します。
         1. 5 mLのポリスチレンチューブに1.25 mLの2x ACCM-2を0.75 mLの水と混合し、適切な抗生物質(375 μg/mlカナマイシンまたは3 μg/mlクロラムフェニコール)を加えて、37°Cでインキュベー
         トします。
         2. 細菌培養物(通常1〜100μl)を加え、5秒間ボルテックスします。
         3. 溶かしたアガロース0.5mlを加えて混ぜ合わせ、すぐに底のアガロースに注ぎます。
         4. 20分間冷まし、ペトリ皿の蓋を元に戻し、4°Cで20分間インキュベートしてアガロースの固化を促進します。
         5. MSCで蓋を外して20分間風乾します。5%_CO2と2.5%_O2の加湿雰囲気下で37°Cでプレートを6〜7日間成長させます。
   2. 残りの細菌培養物にDMSOを添加して最終濃度10%にするまで高め、-80°Cで保存します。
   3. 最適な希釈を次のように評価します:コロニーの直径が0.5〜1 mmで、交差汚染を避けるために適切に分離されていることを確認してください。ポイント1.4.2から残りの細菌培養物を解凍し、1.4.1.2および1.4.1.3で説明されているように、ACCM-2寒天上で適切な希釈でプレート化します。1.4.1.3.5に記載されているように、6〜7日間インキュベートします。
   4. コロニーが検出されたら、1 mLチップの端を切断し、単離されたコロニーを含むプラグをピッキングし、適切な抗生物質(375 μg/mlカナマイシンまたは3 μg/mlクロラムフェニコール)を含む1.5 mLのACCM-2を24ウェルプレートにピペッティングしてコロニーを分散させてコロニーを分散させます。1.3.1に記載されている条件で、個々のコロニーを6日間増幅します。インキュベーションの3日目に、各培養物をピペッティングして細菌の塊を分散させます。
   5. 各変異体懸濁液は、-80°Cで10%DMSO中の96ウェルプレートの2Dバーコード付きスクリューキャップチューブで保存します。
5. 細菌濃度の評価:
   手記：以下のプロトコルを適用して、無菌培地で複製する細菌変異体の成長曲線を得ることができます(1.4.4を参照のこと)。
   1. 標準曲線の準備:
      1. 1x Tris- エチレンジアミン四酢酸 EDTA (TE) に、二本鎖 DNA (dsDNA) (通常は既知のサイズと濃度のランダムプラスミド) の 2 μg/mL ストック溶液を調製します。ストック溶液から 10 倍段階希釈液を調製して、2 μg/ml から 2 ng/ml の範囲の濃度を得ます。各濃度の 50 μl を、壁と底部が黒色の 96 ウェル マイクロプレートの 1 ウェルウェルに分注します (表を参照)。マテリアル)。
      2. dsDNA定量試薬を1x TEバッファーで1:200に希釈し、希釈した試薬55 μlを96ウェルマイクロプレートの各サンプルに加えます。プレートシェーカーを使用してよく混合し、暗所で室温で2〜5分間インキュベートします。
      3. 蛍光マイクロプレートリーダーとフィルターを使用して、標準的なフルオレセイン波長(励起~480 nm、発光~520 nm)でサンプルの蛍光を測定します。
      4. プラスミド濃度範囲を蛍光強度の読み取り値に対してプロットします。
   2. 細菌懸濁液の定量:
      1
      1. ウェルあたり5 μlの10% Triton X-100を、壁と底面が黒い96ウェルマイクロプレートに分注します(材料の表を参照)。各ウェルに50 μlの細菌懸濁液を加え、プレートシェーカーで室温で10分間インキュベー
      トします。
      2. dsDNA定量試薬を1x TEバッファーで1:200に希釈し、希釈した試薬55 μlを96ウェルマイクロプレートの各サンプルに加えます。プレートシェーカーを使用してよく混合し、暗所で室温で2〜5分間インキュベートします。
      3. 蛍光マイクロプレートリーダーとフィルターを使用して、標準的なフルオレセイン波長(励起~480 nm、発光~520 nm)でサンプルの蛍光を測定します。
      4. 細菌のDNA濃度を取得するには、ポイント1.5.1.4で得られたチャートに蛍光測定値をプロットします。DNA濃度をCoxiellaゲノムの質量(2.2 fg)で割って、細菌濃度を求めます。結果をGenome Equivalent/mlで表現します。
      5. ACCM-2で有意な増殖欠陥を示す変異体を廃棄する。

2. シングルプライマーコロニーポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、シーケンシング、アノテーション

>注:次のプロトコルは96サンプルのDNA増幅用であり、次の手順ではマルチチャンネルピペットをお勧めします。磁気ビーズを用いたPCR産物のカラム精製やトランスポゾン特異的プライマー(2.3)によるDNAシーケンシングは、外部企業に委託しています。

1. 増幅プライマーが、逆タンデムリピート(ITR)の上流で100〜200塩基対をハイブリダイズし、Coxiellaゲノム上のトランスポゾン挿入部位をカバーするPCR産物を得るように設計されていることを確認してください。3 mLのPCRミックス(1倍ハイフィデリティバッファー、200 μMデオキシヌクレオシド三リン酸(dNTP)、1 μM増幅プライマー、20 U/mLハイフィデリティDNAポリメラーゼ)を調製し、氷上にセットした96ウェルPCRプレートにウェルあたり29 μlを分注します。ACCM-2の固定相中の各変異体1 μlをPCRミックスに移します。
2. 初期変性(98 °C、1 分)、20 回の高ストリンジェンシーサイクル(98 °C、10 秒、50 °C、30 秒、72 °C、90 秒)、30 回の低ストリンジェンシーサイクル(98 °C、10 秒、30 °C、30 秒、72 °C、90 秒)、および 30 回の高ストリンジェンシーサイクル(98 °C、10 秒)で PCR を実行します。 10秒;50°C、30秒;72 °C、90 秒)、その後、72 °C で 7 分間
延長します。
3. 磁気ビーズを使用してPCR産物を精製し、トランスポゾン特異的プライマーでDNAを配列決定します。トランスポゾン特異的プライマーは、50°Cから75°Cの予測融解温度、GC含量が40%から60%、長さが18〜25ヌクレオチド、増幅プライマーハイブリダイゼーションサイトの下流にアニーリングサイト、トランスポゾンITRの第1塩基対の上流に少なくとも100塩基対を持つプライマーを設計します。
4. 配列解析ソフトウェアを使用して、Coxiella burnetii 493 NMIの完全なアノテーション付きゲノムをロードします。「align to reference」機能を使用して、シーケンシング結果をロードしてアライメント(ブラスト)し、転位の部位を決定します。一致しない変異体やダブルリードを表示している変異体を破棄します。変異体ライブラリの飽和をモニターするには、同じ部位での複数のトランスポゾン挿入の発生を記録します。

>3. 真核細胞によるCoxiella変異体の挑戦と細胞内増殖のモニタリング

>注:次の手順では、マルチチャンネルピペットをお勧めします。感染は、黒い壁と平らで透明な底部を持つ滅菌済みの96ウェルマイクロプレートで3回に分けて行いました。GFPを発現するwt Coxiella burnetiiは、Robert Heinzen博士から提供されました。

1. 抗生物質の非存在下で10%ウシ胎児血清(FBS)を添加したフェノールレッドを含まないRPMIでVero細胞を増殖させます(Complete RPMI培地)。
2. 感染の前日に、コンフルエントまたはサブコンフルエントの細胞培養フラスコからVero細胞を10 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄します。
3. 1 mLのトリプシンEDTA溶液を細胞培養フラスコに添加してVero細胞を剥離し、5% CO₂の加湿雰囲気で37°Cで3〜5分間インキュベー
トします。
4. 10 mLのComplete RPMI培地に細胞を再懸濁します。細胞を数え、1mlあたり⁵細胞10個の細胞懸濁液を調製します。
5. 底が平らで透明な黒色の96ウェルプレートの各ウェルに100 μlの細胞懸濁液を分注します。
6. 室温(RT)で400 x gで5分間遠心分離し、ウェルの底部での細胞接着を促進し、5% CO₂の加湿雰囲気で37°Cで一晩インキュベートします。
7. Coxiella変異体を含む96ウェルプレートをRTで解凍し、150 μlの細菌懸濁液を300 μlのRPMIで希釈し、フェノールレッドおよびFBSを含まないディープウェル96ウェルプレートで
加熱します。
8. Vero細胞を含むマイクロプレートから培地を取り出し、希釈したCoxiella変異体(MOI100)を100 μl/ウェル分注します。A1を陰性(非感染細胞)コントロールとして、A2およびA3をポジティブコントロール(感染の多重度(MOI)100および200でGFPを発現するwt Coxiellaに感染した細胞)として使用します。
9. エアロゾル密閉型遠心分離機プレートホルダーを使用して、RTで400 x gでプレートを10分間遠心分離します。
10. 5% CO₂の加湿雰囲気で37°Cで2時間インキュベートした後、バクテリア含有培地を100 μl/ウェルの新鮮で完全なRPMI培地と交換します。
11. 蛍光マイクロプレートリーダーとフィルターを使用して、標準的なフルオレセイン波長(励起~480 nm、発光~520 nm)のGFP蛍光を7日間毎日測定します。培地中の結露やシグナルの分散による干渉を避けるため、マイクロプレートリーダーで底部励起および発光記録を使用してください。

4. 自動画像取得のためのサンプル調製

>注:この手順は、1つの96ウェルプレートの場合であり、それに応じてボリュームをスケールアップします。4.2の手順では、プレートワッシャーを利用できる場合があります。

1. 感染後7日目に、培地をプレートから取り出し、適切な希釈度(通常は1:1,000、使用する細胞株に応じて最適化)の細胞透過性蛍光色素を含む新鮮で完全な培地50μl/ウェルと交換します。細胞を37°Cで30〜60分間、5%_CO2の加湿雰囲気でインキュベー
トします。
2. 培地をPBS中の4%パラホルムアルデヒド(PFA)50 μl/ウェルと交換し、室温(RT)で30分間インキュベートした後、PFA含有バッファーを取り出してPBSで3回洗浄します。
3. PBSを取り出し、0.05%サポニンを添加したブロッキング溶液(0.5%ウシ血清アルブミン、50 mM塩化アンモニウム、PBS中のNH₄Cl、pH 7.4)を50 μl/ウェル分注します。室温で30分間インキュベートします。
4. ブロッキング溶液を、サポニン(上記参照)および1:500希釈の抗リソソーム関連膜糖タンパク質-1(抗LAMP1)抗体を添加した新鮮なブロッキング溶液40 μl/ウェルで置き換えてください。プレートを室温で30分間インキュベートします。
5. ブロッキング溶液を取り出し、96ウェルプレートを100 μl/ウェルのPBSで5回洗浄します。
6. サポニン(上記)を添加したブロッキング溶液40 μl/ウェルを分注し、適切な蛍光標識二次抗体(希釈度1:1,000)を添加して、ステップ4.4で適用した抗LAMP1抗体を明らかにし、Hoechst 33258を5 μg/ml
で塗布します。
7. ブロッキング溶液を取り出し、96ウェルプレートを100 μl/ウェルのPBSで5回洗浄します。固定細胞が乾燥しないように、最後の洗浄に対応するPBSの量を96ウェルプレートに残します。
8. プレートをすぐに画像化するか、プレートを光から保護して4°Cで保存し、その後の分析に備えます。

5. 画像取得

1. GFP(488 nm、バクテリア)、Hoechst 33258(350 nm、宿主細胞核)、赤色(~555 nm、細胞膜マーカー)、遠赤色(~615 nm、LAMP1)の各チャンネルで、20倍対物レンズを搭載した落射蛍光自動顕微鏡を使用して画像を取得します。ウェルごとに21の独立したフィールドを取得し、サンプルあたり最低5,000個の細胞をイメージングします。宿主細胞の核チャネルを基準としてオートフォーカスを適用します。宿主細胞に感染する割合が低い細菌性病原体を扱う場合、ユーザーはウェルごとにイメージングされる独立したフィールドの数を調整して、分析する感染細胞を最低500個取得できます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
クエン酸	シグマ	C0759-500G	ACCM-2 中型部品
クエン酸ナトリウム	シグマ	S4641-500G	ACCM-2 中型部品
リン酸カリウム	シグマ	60218から100G	ACCM-2 中型部品
塩化マグネシウム	シグマ	M2670-100G	ACCM-2 中型部品
塩化カルシウム	シグマ	C5080-500G	ACCM-2 中型部品
硫酸鉄	シグマ	F8633-250G	ACCM-2 中型部品
塩化ナトリウム	シグマ	S9625-500G	ACCM-2 中型部品
L-システイン	シグマ	C6852-25G	ACCM-2 中型部品
バクトネオペプトン	BD(ベクトン・ディキンソン)	211681	ACCM-2 中型部品
カサミノ酸	BD(ベクトン・ディキンソン)	223050	ACCM-2 中型部品
メチル-B-シクロデキストリン	シグマ	C4555-10G	ACCM-2 中型部品
RPMI w/グルタマックス	ギブコ	〒61870-010	ACCM-2 中型部品
RPMI グルタマックス付き、フェノールレッドなし	ギブコ	32404から014	細胞培養・感染用
ウシ胎児血清	GEヘルスケア	SH30071	細胞培養用
トリプシンEDTA(0.25%)	ライフテクノロジー	〒25200-056	細胞培養用
サポニン	シグマ	47036	免疫蛍光染色用
塩化アンモニウム	シグマ	A9434	免疫蛍光染色用
ウシ血清アルブミン	シグマ	A2153の	免疫蛍光染色用
エレクトロポレーションキュベット0.1cm	ユーロジェンテック	CE0001-50	Coxiella変換の場合
トラックメイトはキャップ付きのトップチューブをねじ込み	サーモサイエンティフィック	3741	2Dバーコード付きスクリューキャップ
96ウェルマイクロプレート、壁と底面が黒	グライナー	655076	フラットダークボトム、dsDNA定量用
96ウェルマイクロプレート、透明、黒色の壁	グライナー	655090	平底透明、細胞培養およびイメージング用
96ウェルPCRマイクロプレート	バイオラッド	2239441	DNAse/RNAseフリー
96ウェルプレート、ディープウェル	ラボコン	949481	Coxiella変異体感染症の場合
ピコグリーン	ライフテクノロジー	P7581	dsDNA定量用
トリトンX-100	シグマ	T9284-500ミリリットル	dsDNA定量用
Phusion ハイフィデリティ DNA ポリメラーゼ	ニューイングランドバイオラボ	M0530Lの	シングルプライマーコロニーPCR用
セルトラッカーレッドCMTPX	ライフテクノロジー	C34552	イメージング用
抗LAMP1抗体	シグマ	94403-1ミリリットル	免疫蛍光染色用
ヘキスト33258	シグマ	L1418	イメージング用
蛍光マイクロプレートリーダー Infinite 200 Pro	テカン
落射蛍光自動顕微鏡 Cellomics	サーモサイエンティフィック

の ます 名 型