嫌気性細菌-宿主細胞相互作用を研究するための細菌感染アッセイ

要約

出典: Wunsch, C. M., et al. Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells. J. Vis. Exp. (2015)

このビデオは、嫌気性病原性細菌であるPorphyromonas gingivalisがヒトの臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)に付着して侵入する能力を評価する技術を示しています。宿主細胞に細菌を感染させた後、宿主細胞を溶解して、付着した細菌と内在化した細菌の両方を放出します。ライセートを適切な培地に播種すると、コロニーの存在は細菌と宿主細胞の相互作用が成功したことを示します。

プロトコル

次のプロトコルでは、嫌気性種であるP. gingivalisの侵入を培養および研究する方法を説明します。ただし、これらのプロトコルは、多くの嫌気性病原体に使用される場合があります。HUVECが使用されますが、このプロトコルは、免疫細胞と非免疫細胞の両方の他の真核細胞にも使用できます。

1. 嫌気性チャンバーの使用とメンテナンス

>注:P. gingivalisは、周囲の空気中に遭遇する酸素の正常レベルに敏感な嫌気性菌です。制御された嫌気性環境は、P. gingivalisの栽培に不可欠です。

1. ここでは、混合嫌気性ガス(80%_N2、10%_H2、10%CO₂)として指定された人工雰囲気をビニール嫌気チャンバー(図1A)に維持します。エアロック(図1B)を使用して、実験室環境から嫌気性チャンバーにアイテムを移します。エアロックは手動で作動し、混合嫌気性ガスを導入する前に_N2ガスで2回パージします。
2. 硫化水素除去カラム(図1C)を使用して、望ましくない硫化水素をメンテナンスフリーで除去します。チャンバー内に除湿機を配置して、触媒によって生成されたH₂Oを除去し、汚染の拡大を促進するエアロゾルを回避します.
   手記：硫化水素は、多くの嫌気性細菌の天然代謝副産物であり、その蓄積は細菌に対して毒性があり、電子機器に損傷を与え、触媒の寿命を縮める可能性があります。
3. ファンボックスを使用して、パラジウム触媒を介してチャンバーの雰囲気を循環させ、水素の存在下で酸素を除去します(図1D).
   注:再循環大気(高効率微粒子空気またはHEPA)フィルターは、0.22μm以上のサイズの空気中の汚染物質を除去します。
4. 嫌気性細菌を嫌気性チャンバー内にある37°Cのインキュベーターで培養します。嫌気性チャンバー内で作業する場合は、標準的な無菌技術を使用してください。

>2. 嫌気性細菌の調製

>注:P. gingivalisは耐空性があり、好気性条件下で保存することができますが、6%を超えるレベルでは酸素の存在下では成長しません。P. gingivalisやその他の嫌気性種を適切に培養するには、嫌気性チャンバーが必要です(図1)。マイクロ嫌気性菌を扱う前に、嫌気性チャンバーの使用に関する適切なトレーニングと教育が必要です。

1. 実験前に、すべての液体培地とプレートを嫌気性条件に少なくとも12時間平衡化して、残留酸素を除去します。
2. P. gingivalisを-80°Cの冷凍庫から嫌気性チャンバーに移し、解凍します。
3. トリプチカーゼ大豆血液寒天プレート(TSA IIと5%の羊の血液)上のP.ジンジバリスの縞模様。プレートをパラフィルムで包み、嫌気性インキュベーターで37°Cで4〜7日間保存します。
4. P. gingivalisを、ヘミンとメナジオン(嫌気性微生物および気難しい微生物の単離および培養のための濃縮された非選択的液体培地)を補充した3mlの脳心臓注入(BHI)ブロスに無菌ループを使用して接種します
   手記：長期保存の場合は、BHIで調製した細菌培養物をグリセロールまたはDMSO(最終濃度10〜20%)と混合し、-80°Cの冷凍庫に入れます。
5. P. gingivalisのスターター培養物を調製するには、1:10の希釈を行い、細菌を中対数期まで増殖させます。

注:細菌懸濁液の光学濃度を決定し、検査する各菌株の細菌濃度を調整します。P. gingivalisの場合、OD₆₆₀の懸濁液は0.7で、中対数期および~7 x 10⁸細胞/mlに相当します。上記のプロトコルに記載されている増殖条件は、P. gingivalisに特異的であり、他の細菌株に適応させる必要があるかもしれません。

3. 内皮細胞培養

>注:プールされた一次HUVECを購入し、メーカーの指示に従って、血管内皮増殖因子(VEGF)を含む基礎培地で5%_CO2の37°Cで培養してください。

1. T-75フラスコ中の種子HUVECs、2.5 x 10 5細胞/フラスコ、15 mL VEGF培地中.
   手記： 4.0%トリパンブルーで1:1に希釈して生存率を確認します。膜が損なわれた細胞はトリパンブルーを保持し、無傷の膜を持つ健康な細胞は双眼光学顕微鏡で見ると白く見えます。100個の細胞を数え、細胞の80%以上が生存可能であることを確認します。
2. 細胞の密度が~80%に達するまで、2日ごとに培地を予熱した新鮮なVEGF培地と交換します。
3. 予熱したリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を一度洗浄します。2 mLのトリプシン-EDTA(0.25%)と5分間インキュベートした後、2 mLのトリプシン中和溶液をインキュベートすることにより、T75フラスコから細胞を遊離します。
4. 懸濁したHUVECを50 mLの円錐管に集めます。T-75フラスコから余分な細胞をPBSで洗い流し、50mlの円錐管に移します。
5. 細胞を200 x gで10分間遠心分離します。
6. 上清を取り除き、細胞ペレットを10 mLの温めたVEGF培地に懸濁します。
7. 血球計算盤または同様の細胞計数装置を使用して細胞濃度を測定します。
8. 6ウェルプレート(400,000/ウェル)またはカバースリップ付き12ウェルプレート(50,000/ウェル)のいずれかに添加する細胞懸濁液の量を計算します。HUVECは翌日から実験の準備が整います。

4. サバイバルアッセイの侵入/相互作用(めっき)

>注:このアッセイを実行するときは、400,000細胞/ウェルで播種した内皮細胞の2つの6ウェルプレートを準備してください。1 つのプレートを使用して、宿主細胞に付着し、宿主細胞によって取り込まれた細菌を評価します。もう一方のプレートは細胞内細菌を考慮します。6ウェルプレートにより、1回の実験で2つのサンプルのトリプリケートを実行できます。このプロトコルの概要については、生存アッセイのフローチャート(図2)を参照してください。

1. 上記のように嫌気性細菌を調製します(セクション1を参照)それらが中丸太成長(OD₆₆₀ 0.5-0.7)に達するまで
。
2. 細菌を5,000 x gで10分間遠心分離
   注:遠心分離機が嫌気性チャンバーの外にある場合は、細菌サンプルを密閉された15 mlチューブに入れて運び、酸素漏れを防ぐためにキャップをパラフィルムで包みます。
3. ペレット状にしたP.ジンジバリスをチャンバーに戻し、上清を捨てます。PBSで洗浄し、VEGF培地に再懸濁する前に細菌を再度ペレット化します。試験するすべての細菌株の懸濁液を、中対数期(~7 x 10⁸細胞/ml)に対応するOD₆₆₀ 0.7で調製します。これで、細菌は感染する準備が整いました。
4. HUVECを含む6ウェルプレートを組織培養インキュベーターから嫌気性チャンバーに移します。メディアを取り除き、嫌気性PBSで3回洗浄します。2 mLの嫌気性VEGF培地を各ウェルに加え、プレートを37°Cの嫌気性インキュベーターに20分間置いて、感染の温度を平衡化します
   手記： 血液寒天プレートに細菌をプレート化して、感染に使用されるものが均質で、感染時に汚染されていないことを確認します。
5. 100:1.
   の感染の多重度(MOI細菌:宿主)で宿主細胞に細菌を感染させます 手記：HUVEC細胞数は、感染前に1つのウェルでトリパン排除試験を行うことにより決定されます。細菌の細胞数は、光学密度によって決定されます(例:OD0.5 = 5 x 10⁸細胞/ml)。細菌の濃度は、HUVECの濃度に基づいて適切なMOIに調整されます。
6. 感染したHUVECを入れた6ウェルプレートを嫌気性インキュベーターに入れ、細菌が宿主細胞と30分間相互作用するのを待ちます。
7. 嫌気性チャンバー内でBHI(1.0%w / v)でサポニンを調製し、0.2μmフィルターでろ過します。
8. 付着した細菌と内在化された細菌の両方の生存。
   1. インキュベーターからプレートを取り出し、培地を吸引し、嫌気性PBSで3回洗浄し、ろ過した1.0%サポニン2 mL(ステップ4.8で調製)を加えます。15分間インキュベートして、宿主細胞を溶解します。
   2. 各ウェルの底をセルスクレーパーでこすり落とします。各ウェルから細胞混合物を回収し、BHIで1:1に希釈します。
   3. サンプルの段階希釈に進みます。細菌の種類や濃度に応じて、段階希釈を調整します。1:100または1:1,000の希釈から始めます。
   4. 血液寒天培地プレートに希望の希釈液200μlをプレートします。プレートをパラフィルムで包み、37°Cの嫌気性インキュベーターに入れます。
   5. 37°Cで7日間インキュベートした後、プレートを取り出し、ライトボックスを使用してコロニー形成単位(CFU)をカウントし、手動でコロニーをカウントします
      手記： CFU が列挙されます。CFUの量が多い場合は、画像を撮影したり、コンピュータソフトウェアを使用してCFUの列挙を容易にすることができます。

結果

図 1.嫌気性ビニールチャンバーとそのコンポーネント。(A)大気中の酸素から完全に密閉されたビニール嫌気性チャンバーは、一度に2人の個人(32インチx 78インチ)のワークスペースを提供します。37°C(背面中央)に設定されたインキュベーターが含まれています。(B)エアロックは、ラボ環境から嫌気性チャンバーへのアイテムの移動に使用されます。写真は、嫌気性環境を作り出すために必要な真空およびパージ手順を自動的に実行するようにプログラムできるコントローラーを介して操作される自動エアロックです。(C)硫化水素除去カラムは、望ましくない硫化水素をメンテナンスフリーで大容量で除去します。(D)嫌気性チャンバー全体に2つの触媒ファンボックスが配置され、水素の存在下で酸素を除...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ビニール嫌気性チャンバー-タイプB	コイラボラトリー製品		2000年型インキュベーター
TSA II トリプチカーゼ 大豆寒天 5% 羊の血液	バレル	221261
人間の臍帯静脈内皮細胞10ドナープール	ライフラインテクノロジー	FC-0044
VascuLife VEGF ミディアムコンプリートキット	ライフラインテクノロジー	LL-0003
トリプキット	命綱	LL-0013
サポニン	リーデル・デ・ヘン	16109