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1. 細菌の宿主細胞への内在化(蛍光顕微鏡)
>注:P. gingivalisは、2',7'-Bis-(2-カルボキシエチル)-5-(および-6)-カルボキシフルオレセイン、アセトキシメチルエステル(BCECF-AM)で標識されています。BCECF-AMは、非蛍光膜透過性色素です。細胞内エステラーゼの作用によるフルオレセインBCECFへの変換は、細胞の生存率を示すことができます。P. gingivalisはBCECF-AM色素で標識され、真核細胞に感染するために使用されます。感染後、細胞を固定し、DAPIおよびTRITC-ファロイジンで標識します。真核細胞の核を染色するために使用されるDAPI染色は、細菌の細胞核にも標識を付け、BCECF-AMを代謝的に切断できない生存不能な細菌を特定するための対策を提供します。宿主細胞は、赤色アクチン色素であるTRITC-ファロイジンで強調表示されています。
- オートクレーブカバースリップ。12ウェルプレートにカバースリップを無菌的に添加してから、内皮細胞を5 x 104細胞/ウェルに播種します。(実験前日準備)
- 上記のように、12ウェルプレートの18 mm(#1.5厚さ)の円形カバースリップ上に内皮細胞を調製します。
- 中対数期(OD660 = 0.5-0.7)まで増殖した嫌気性細菌を調製します。
- 5,000 x gで遠心分離し、ペレットをPBSで5-7 x 108細胞/ mlで懸濁することにより、嫌気性PBSで細菌を2回洗浄します。
- 20 μLの0.2 mM BCECF-AMを2 mLの細菌懸濁液 (5-7 x10 8 cells/ml) に加え、最終濃度のBCECF-AMを2 μMにします。
- 暗所で37°Cで30分間インキュベートします。
- 18 mm(#1.5厚さ)の円形カバースリップに播種した内皮細胞を組織培養インキュベーターから嫌気性チャンバーに移します。PBSで洗浄し、嫌気性VEGF培地と交換してください.
注:HUVECが光学顕微鏡で健康であることを確認してください。HUVECSは~80%がコンフルエントであるべきで、形態はメーカーと同等でなければなりません。
- 標識細菌を5,000 x gで10分間遠心分離し、残留BCECF-AM色素を除去します。2 mLの嫌気性VEGF培地に懸濁します。
- MOIが100:1の標識細菌(細菌:宿主)を宿主細胞に感染させます。
- 嫌気性チャンバーで37°Cで30分間インキュベートします。
- 感染後、細胞をPBSで3回洗浄し、新たに調製した4.0%パラホルムアルデヒドに10分間固定します
手記：細胞を固定した後、嫌気性チャンバーの外で実験を行うことができます。
- カバースリップをPBSで3回洗います。
- 0.2% Triton X-100 1 mLを10分間加えます。
- カバースリップをPBSで3回洗います。
- TRITCファロイジン50μl(50μg/ml)をカバースリップに45分間加えます。
- カバースリップを3回洗浄し、12ウェルプレートから取り出し、DAPI を含むソフトセット封入剤をスライド上に置きます。側面をマニキュアで密封します.
手記： スライドは、暗闇の中で数か月間保管できます。光の退色を防ぐために、光への露出を避けてください。
- 共焦点顕微鏡を使用してスライドを表示します。
- ここでは、電動XYステージを備えたAxioObserver(倒立型)スタンドの周囲に構成された34チャンネルスペクトルシステム(32チャンネルアレイ検出器と2サイドPMT検出器、および透過光検出器)を使用します。このシステムには、青色ダイオード(405 nm)、マルチラインアルゴン(458、488、514 nm)、緑色ダイオード(561 nm)、赤色HeNe(633 nm)、440 nmパルスレーザーの5つのレーザーがあります。蛍光ライフタイムイメージングシステムに2つのハイブリッドGaAsP検出器(FRET-FLIM用)を装備します。
- 励起波長が340-380 nmと540-560 nmのデュアルバンドフィルターと、それぞれ435-485 nmと570-590 nmの蛍光フィルターを使用して、DAPIとTRITCからの蛍光を1つのチャネルで検出します。励起波長440-500nmのフィルターと510-590nmの蛍光フィルターを用いてBCECF-AMからの蛍光を検出します
手記：BCECF-AMの制御は、生存可能な細菌の適切な標識を確保するために、研究対象のすべての細菌株に対して行う必要があります。まず、生存不能な細菌がDAPI陽性でBCECF陰性であることを検証します。次に、生きた細菌がBCECF-AMをフルオレセインBCECFに代謝できることを確認します。最適な標識のためには、細菌またはBCECF-AM色素の濃度が変動する試験が必要な場合があります。