細菌性病原体に対するオプソノファゴサイトーの殺傷活性の評価

要約

出典:Paschall, A. V. et al., 細菌性病原体に対する免疫学的応答を評価するためのオプソノファゴサイトーク殺傷アッセイ。J. Vis. Exp.(2019年)

ビデオは、ヒト好中球と肺炎連鎖球菌の共培養を使用したin vitroオプソノファゴサイトー殺傷アッセイを示しています。抗体と補体タンパク質は細菌のオプソニン化を促進し、好中球が細菌を認識して殺すことを可能にし、好中球のオプソノファゴサイトーシス活性が成功します。

プロトコル

1. HL-60細胞の培養・分化・バリデーション

1. L-グルタミンを含む500 mLのロズウェルパーク記念研究所(RPMI)と50 mLの熱不活化ウシ胎児血清で構成されるHL-60細胞培養培地を調製します。抗生物質はHL-60細胞の分化に影響を与える可能性があるため、添加しないでください。
2. HL-60細胞の増殖/維持のために、5 x 10⁶細胞を10 mLのHL-60細胞培養培地で75 cm²ベントフラスコに入れ、37°Cおよび5%二酸化炭素(CO₂)で培養します。最適な細胞濃度を維持するために、3〜4日ごとに細胞を継代します.
   手記： 細胞濃度は5 x 10⁶ / mLを超えてはなりません。
3. HL60培養培地中のHL60培養培地に10%ジメチルスルホキシド(DMSO)を含む約1 x 10⁶細胞/mLを1 mLの極低温チューブに分注することにより、HL-60細胞のワーキングストックを生成します><。 手記： 作業用ストックは-80°Cで保存できます。マスターストックは-120°Cで保存する必要があります。
4. HL-60細胞を分化するには、15 mLのHL-60細胞培養培地で1.5 x 10⁷細胞を0.6% N、N-ジメチルホルムアミド(DMF)、37°Cで、5% CO₂で滅菌フィルターキャップ付き75 cm²フラスコで3日間培養し、オプソノファゴサイトーシス活性(OPKA)を行います。
5. HL-60細胞が成功裏に分化し、確立されたフローサイトメトリープロトコルに従って生存率と細胞表面マーカーをテストすることにより、OPKAアッセイでの使用に適していることを検証します。分化後、HL-60細胞を回収し、CD71、CD35、アネキシンV、およびヨウ化プロピジウムの蛍光標識抗体/染色剤で約1 x 10⁴細胞を染色します
   手記： 分化した細胞は、確立された検証プロトコルを通じて決定されたように、生存率が65%≥、CD35⁺が≥55%、CD71⁺が≤20%である必要があります(図1)。

2. OPKAバッファーと試薬の調製

1. 42.5 mLの滅菌1倍リン酸緩衝生理食塩水(PBS)をCa²⁺/Mg²⁺、5 mLの熱不活化ウシ胎児血清、および2.5 mLの0.1%滅菌ゼラチンと混合して、50 mLの滅菌オプソニン化バッファーB(OBB)を調製します。4°Cで保存してください。
2. 赤ちゃんウサギの補遺物を入手し、-80°Cで保存します。
3. 細菌培養プレート(すなわち、15 x 100 mm² 5%羊の血液寒天プレート)を入手または調製します。

3. 細菌ストックサンプルの調製

1. 検査する細菌株のストックを取得します.
   注: このプロトコルでは、血清型 3 肺炎球菌 (WU2、Moon Nahm 博士から寛大に提供) が使用されます。
2. 適切なブロス(すなわち、トッドヒューイットブロス+ このWU2株の0.5%酵母抽出物)で細菌株を37°C.
   で約2〜4時間増殖させます 手記： 培養物の600nm(OD₆₀₀)での光学密度は、0.6〜0.8である必要があります。
3. 6,000 x gで2分間遠心分離することにより細菌をペレット化し、細胞を適切なブロス中の15%グリセロールの10-30 mLに再懸濁します。細菌培養物(1分あたり500 μL)を滅菌済みの1.5 mL遠心チューブに分注し、-80°Cで保存します。
4. 細菌ストックのバイアル1本を37°Cの水浴で解凍します。細菌細胞をペレット化し、無菌条件下で500 μLのOBBに再懸濁します。
5. OBB中の細菌ストックの異なる希釈液を調製します(すなわち、希釈なしの10μL、1:10の10μL、1:100の10μLなど)。未処理の細菌ストックのさまざまな希釈液を使用して、以下に説明するようにOPKAアッセイ(HL-60/補体共培養を含むセクション4〜6)を実行します。プレートを30°C(CO₂なし)で一晩培養します
   手記： 30°Cの温度は、過成長を防ぐためのWU2に特有の温度です。他の株/血清型は、37°Cで最適に増殖する可能性があります。
6. HL-60細胞および補体と共培養した未処理の細菌ストックの各希釈について、コロニーをカウントします。どの希釈細菌が最適な数カウントコロニーをもたらすかを決定します(HL-60細胞と共培養した未処理の細菌の場合、約80-120コロニー形成単位(CFU))。この細菌ストックが関与する将来のOPKAについては、この希釈に注意してください。

4. 細菌の治療と培養

1. ステップ3.3で調製した細菌ストックのチューブ1本を解凍します。バクテリアをペレット化し(6,000 x gで2分間)、ステップ3.6で決定した最適な希釈で細胞ペレットをOBBに再懸濁します。
2. 1ウェルあたり10 μLの再懸濁細菌希釈液を丸底の96ウェル細胞培養プレートにピペットで保存します。
3. 20 μLの適切な抗体または薬物処理を各実験ウェルに二重に加えます.
   注:このプロトコルでは、マウスで生成された血清型特異的抗体を治療Xとして追加し、血清型3多糖カプセルを分解することが知られている配糖体加水分解酵素を治療Yとして追加します(図2)。コントロールウェルの場合は、処理ウェルに使用するバッファーに応じて、1x PBSまたはOBBを使用します。
4. サンプルプレートを約90rpmで室温で1時間振とうします。これらの条件は、試験する処理の最適な温度または振とう条件に応じて調整します。

5. HL-60細菌共培養

1. 3日前(ステップ1.4を参照)にDMFで処理したHL-60分化細胞を15mLのコニカルチューブに回収して、HL-60細胞を調製します。細胞をペレット化し(500 x g、3分)、上清を捨て、少なくとも10 mLの1x PBSで洗浄します。
2. 洗浄した細胞をペレット化し(500 x g、3分)、上清を廃棄し、細胞をOBBに再懸濁します(1 mLのOBBから開始し、細胞計数後に最終濃度を1 x 10⁷ / mLに調整します)。
3. 赤ちゃんウサギ補体(滅菌、希釈されていない赤ちゃんウサギ血清、3〜4週齢)を1:5の最終容量で追加します><。 手記： HL-60補体混合物の最終濃度は、1 x 10⁷ / mLである必要があります。補体依存性を試験する場合は、熱不活性化補体を含む活性HL-60細胞を含む第2の溶液を使用することができます(補体は、>55°Cの水浴中で少なくとも30分間インキュベートすることにより不活性化できます)。
4. 1時間の細菌培養が完了した後(ステップ4.4)、各サンプル(つまり、各30 μLのサンプルウェルの10 μLを2つの新しいウェルに)を2つのグループの重複ウェルに分割します(つまり、ピペッティングエラーを考慮して、元の30 μL共培養物の20 μLのみを使用します):1つのセットをHL-60補体と共培養し、1つのセットに細菌のみを含めます。HL-60補体混合物(ステップ5.3)を50 μLを各実験ウェルセット(委任された+HL-60)に加えます。50 μLのOBBのみを細菌のウェルに加えます(委任-HL-60).
   手記： この例では、約800個の細菌CFUを5 x 10⁵/50 μL HL-60細胞との初期共培養に使用します。この感染の多様性が、最終的なコロニー数で示されるように高すぎるか低すぎる場合は、HL-60細胞数ではなく、初期細菌希釈を調整します。
5. 96ウェルプレートを37°Cで1時間(CO₂なし)振とうします。

6. サンプルめっきと一晩のインキュベーション

1. 各ウェルをOBBで1:5に希釈し、各サンプルの容量が少なくとも50 μLになるようにします。
2. 各サンプル50μLを細菌培養プレートの指定された領域に直接ピペットで固定し、サンプル間の適切な間隔を確保します。15 x 100 mm² 個の丸型寒天プレートの場合、約 4 つのサンプルを 1 つのプレートにピペッティングします。
3. 蓋をして、サンプルを室温で約15分間乾燥させます。
4. プレートを反転させ、30°C(CO₂なし)で一晩培養します。あるいは、無酸素状態が細菌の増殖に影響を与えるかどうかをテストしたり、形態を制御したりするために、嫌気性ジャーでプレートを培養します。
5. 一晩培養した後、指定された各サンプルエリアのコロニーを数えます。各セットの生細胞の数を、HL-60細胞共培養を受けていない対応するコントロールおよび/またはサンプルと比較することにより、データを分析します(細胞生存率100%、細胞死率0%を示します)。

結果

図1:フローサイトメトリーによるHL-60細胞分化の検証。分化したHL-60細胞を回収し、洗浄し、1 x 10⁵細胞/mL PBSに再懸濁しました。次に、細胞を96ウェルプレートで12ウェル(100 μL/ウェル)に分注しました。次に、細胞を蛍光標識抗CD35、抗CD71、アネキシンV、およびヨウ化プロピジウムで染色しました。未染色の細胞または蛍光標識アイソタイプ抗体で染色した細胞をコントロールとして使用しました。

図2:治療Yは、HL-60を介した細菌の細胞死を改善します。...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アネキシンV(APC標識)	バイオレジェンド	640919
抗CD35、ヒト(PE結合)	バイオレジェンド	333405
抗CD71、ヒト(PE結合)	バイオレジェンド	334105
使用する細菌株(すなわち、Streptococcus pneumoniae、WU2)	細菌呼吸器参照研究室(Dr. Moon Nahm)
血液寒天プレート	ハーディ診断	A10
胎児クローン血清	ハイクローン	03 SH30080
グリセロール	シグマ	G9012-1L
HL-60細胞	ATCCの	CCL-240
IgGアイソタイプコントロール(PE標識)	バイオレジェンド	400907
N,N-ジメチルホルムアミド(DMF)	フィッシャーケミカル	UN2265
ヨウ化プロピジウム	シグマ	P4864
L-グルタミンを含むRPMI培地	コーニング	10-040-CV

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