宿主内皮細胞における内在化ポルフィロモナス・ジンジバリスの評価

要約

出典: Wunsch, C. M., et al. Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells. J. Vis. Exp.(2015年)

このビデオでは、ヒト内皮細胞内のPorphyromonas gingivalisの生存率を評価するためのアッセイを実演しています。内在化したPorphyromonas gingivalisの生存と成長の尺度は、血液寒天プレート上のコロニーの数によって評価されます。

プロトコル

1. 内在化細菌の生存。

1. P. gingivalis嫌気性細菌を、丸太の成長が中程度になるまで調製します(OD₆₆₀ 0.5-0.7)。
2. 細菌を5,000 x gで10分間遠心分離します。
3. ペレット状にしたP.ジンジバリスをチャンバーに戻し、上清を捨てます。PBSで洗浄し、VEGF培地に再懸濁する前に細菌を再度ペレット化します。試験するすべての細菌株の懸濁液を、中対数期(~7 x 10⁸細胞/ml)に対応するOD₆₆₀ 0.7で調製します。これで、細菌は感染する準備が整いました。
4. HUVECを含む6ウェルプレートを組織培養インキュベーターから嫌気性チャンバーに移します。メディアを取り除き、嫌気性PBSで3回洗浄します。各ウェルに2 mLの嫌気性VEGF培地を加え、プレートを嫌気性インキュベーターに37°Cで20分間置いて、感染の温度を平衡化します。
5. 100:1.
   の感染の多重度(MOI細菌:宿主)で宿主細胞に細菌を感染させます 手記：HUVEC細胞数は、感染前に1つのウェルでトリパン排除試験を行うことにより決定されます。細菌の細胞数は、光学密度によって決定されます(例:OD0.5 = 5 x 10⁸細胞/ml)。細菌の濃度は、HUVECの濃度に基づいて適切なMOIに調整されます。
6. 感染したHUVECを入れた6ウェルプレートを嫌気性インキュベーターに入れ、細菌が宿主細胞と30分間相互作用するのを待ちます。
7. 嫌気性チャンバー内でBHI(1.0%w / v)でサポニンを調製し、0.2μmフィルターでろ過します。
8. インキュベーターからプレートを取り外します。嫌気性PBSで3回洗浄し、抗生物質を添加したVEGF培地2 ml(ゲンタマイシン300μg/ml、メトロニダゾール400μg/ml)を加えます。
9. 抗生物質が目的の細菌株を100%殺す効果を発揮し、宿主細胞に浸透しないことを確認するために、抗生物質を必ずテストしてください。
10. 培地を吸引し、ろ過した1.0%サポニンを2 mL加えます。15分間インキュベートして、宿主細胞を溶解します。
11. 各ウェルの底をセルスクレーパーでこすり落とします。各ウェルから細胞混合物を回収し、BHIで1:1に希釈します。
12. サンプルの段階希釈液(1:100、1:1,000)を調製します。
13. 血液寒天培地プレートに希望の希釈液200μlをプレートします。プレートをパラフィルムで包み、嫌気性インキュベーターに入れます。
14. 37°Cで7日間のインキュベーション後、プレートを取り出し、CFUをカウントします。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ビニール嫌気性チャンバー-タイプB	コイラボラトリー製品		2000年型インキュベーター
TSA II トリプチカーゼ 大豆寒天 5% 羊の血液	バレル	221261
人間の臍帯静脈内皮細胞10ドナープール	ライフラインテクノロジー	FC-0044
VascuLife VEGF ミディアムコンプリートキット	ライフラインテクノロジー	LL-0003
トリプキット	命綱	LL-0013
サポニン	リーデル・デ・ヘン	16109
ゲンタマイシン硫酸塩	シグマ・アルドリッチ	G-1264
メトロニダゾール	シグマ・アルドリッチ	M-3761