腫瘍特異的抗体のin vivo局在を評価する技術

要約

出典:Shivange, G., et al. 標的抗原特異的治療抗体の腫瘍および組織分布の分析。

このビデオは、マウス腫瘍異種移植モデルにおける腫瘍特異的抗体のin vivo局在を研究する技術を示しています。マウスにがん細胞を皮下注射して腫瘍形成を行うと、腫瘍特異的受容体に結合する蛍光標識抗体を注入し、イメージングによる抗体の局在をin vivoで評価することができます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 抗体の発現と精製

1. チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞の維持
   1. 市販の1倍グルタミンサプリメントを添加したFreeStyle CHO培地でCHO細胞を増殖させ、37°Cで130rpm、5%_CO2で振とう、ガラス製または使い捨てのdelong Erlenmeyerフラスコを使用します。
      手記：攪拌を増やし、振とう条件でのガス移動を改善するために、通気口付きキャップ付きのバッフルフラスコを使用することを強くお勧めします。懸濁液培養の攪拌が限られているため、通常のフラスコ(非バッフル)では、抗体収量が大幅に減少しています。
   2. 細胞数を1〜5 x 10⁶細胞/mLに維持し、細胞生存率は>95%です。細胞数が5 x 10⁶細胞/mLを超えて増加した場合は、細胞を分割します。CHO細胞が0.2 x 10⁶細胞/mL未満に達するのを絶対に許可しないでください。
2. CHO細胞のトランスフェクション
   1. 200 mLの培地(2 x 10⁶細胞/mL)でCHO細胞を増殖させ、デロング三角バッフルフラスコで増殖させます
      手記： バッフルフラスコで増殖した懸濁培養物は、非バッフルフラスコで増殖した場合と比較して、常に高いタンパク質収量を生み出しています。
   2. 15 mLのチューブに5 mLのCHO FreeStyle培地を取り、50 μgのVHクローンDNAと75 μgのVLクローンDNAを加えます。よく混ぜる渦
   。
   3. DNA混合物を室温で5分間インキュベートします.
      手記：インキュベーションが長くなると、タンパク質の収量が減少します。
   4. DNA溶液に1 mg/mLポリエチレン(PEI)ストック750 μLを加え、混合物を30秒間積極的にボルテックスします。室温でさらに5分間インキュベートします
      手記：PEIは新鮮にする必要があります。PEIの複数回の凍結融解サイクルは、全体的な収量を大幅に減少させます。
   5. DNAとPEIの混合物全体を細胞に加え、フラスコを手動で振とうします。すぐに、デロング三角バッフルフラスコを37°Cの細胞で130rpmで振とうします。
3. 式
   手記：この抗体は、N末端まで操作された分泌シグナルペプチドを有しており、これにより抗体が培地中に分泌されるのを助けます。
   1. トランスフェクションした細胞を37°Cで増殖させ、1日目に130 rpmで振とうします。
   2. 2日目に、2 mLの100倍凝集防止剤と2 mLの100倍抗菌抗真菌溶液を加えます。フラスコを130rpmで振とうしながら、より低い温度(32〜34°C)に移します。
   3. 5日おきに、10 mLのトリプトンN1フィードと2 mLの100倍グルタミンサプリメントを追加します。.
   4. トリパンブルー染色で細胞のアリコートを染色した後、血球計算盤を使用して3日ごとに細胞を数え続けます。細胞生存率が80%を超えていることを確認してください。
   5. 10日目または11日目に、抗体精製のために培地を回収します。培養物を3000 x g、4°Cで40〜60分間遠心し、0.22 μMボトルフィルターを使用して透明培地をろ過します。
4. 精製
   手記：抗体の精製は、市販のProtein-Aカラム(材料表を参照)を使用し、ペリスタルティックポンプを使用して行います。
   1. 2カラム容量の結合バッファー(pH 7.4で20 mMリン酸ナトリウム)でカラムを平衡化します。
   2. 抗体を含むろ過培地(ステップ1.3.5で取得)を1 mL/minの流速でカラムに通します。
   3. 2カラム容量の結合バッファーでカラムを洗浄します。
   4. 5 mLの溶出バッファー(pH 3.4の30 mM酢酸ナトリウム)を使用して、抗体を500 μLの画分に溶出します。
   5. 溶出した抗体のpHを中和するには、10 μLの中和バッファー(pH 9で3 M酢酸ナトリウム)を1フラクションあたり10 μL加えます。
      手記： 分数3-6には、ほとんどの抗体が含まれています。抗体が予想よりも遅い画分で溶出される場合に備えて、すべての画分を保持することをお勧めします。
   6. 分光光度計を使用して精製された抗体の濃度を測定するには、免疫グロブリンG(IgG)のデフォルトプロトコルを選択します。抗体の最終濃度は、分子量と吸収係数を考慮してmg/mLで求められます。

2. 蛍光ラベリング

>注:抗体は、タンパク質に結合して安定なコンジュゲートを形成するNHSエステル反応基を含む赤外線色素で標識されます。この反応はpHに敏感で、pH 8.5で最もよく機能します。色素で標識された蛍光コンジュゲートは、最大吸収774 nm、最大蛍光789 nmを示します。pH 8.5は、効果的なコンジュゲーションの鍵です。

1. 1 Lの標識緩衝液(pH 8.5の50 mMリン酸緩衝液)中の透析カセット(0.1-0.5 mL)を使用して、抗体0.5 mLを透析します。4時間後、透析カセットを新しいバッファーに移し、一晩透析します。
2. 抗体1 mgあたり0.03 mgのIRDye 800CWを反応容量500 μL.
   に添加して、標識反応を設定します。 手記：IRDye 800CWは、10 mg/mLの濃度でDMSOに溶解します。
3. 20°C.
   で2時間標識反応を行います。 手記：時間を 2 時間を超えて増やしても、ラベル付けは改善されません。
4. 標識コンジュゲートを1x PBSに対する広範な透析により精製します。
5. 780 nm での色素の吸光度と 280 nm でのタンパク質の吸光度を測定することにより、標識の程度を推定します。280 nm シグナルに対する色素の寄与は 3% です。
6. 次の式を使用して色素/タンパク質比を計算します:
   
   ここで、0.03 は 280 nm で使用される色素の吸光度の補正係数 (780 nm での吸光度の 3.0% に等しい)、εDye と εProtein はそれぞれ色素とタンパク質 (抗体) のモル吸光係数です。
   注:PBS:メタノールの1:1混合物中のε染料は270,000 ^{M-1 cm-1}、εProteinは203,000 ^{M-1 cm-1}(典型的なIgGの場合)です。IgG以外のタンパク質は、モル吸光係数が非常に異なる場合があります。目的のタンパク質の正しい吸光係数を使用することは、D/P比を正確に決定するために不可欠です。
7. 次の式を使用して最終的なタンパク質濃度を計算します:
   
   手記：in vivo研究に進む前に、必ずELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)またはフローサイトメトリーを使用して、標識抗体および非標識抗体の抗原結合効果を確認してください。

>3. マウス異種移植片の研究

1. 注射用腫瘍細胞の調製
   1. RPMI-1640培地でOVCAR-3細胞を増殖させ、FBSの10%と1xペニシリン-ストレプトマイシンを添加します。
   2. 注射の前日に、10 mLの完全培地/皿を使用して、細胞を新しい100 mm培養皿に継代培養します。セル番号は0.5-1 x 10⁶セル/皿です。
   3. 37°Cの温度、95%の湿度、および5%のCO₂で培養物を20〜24時間インキュベートします。
   4. 注射当日は、培養皿から増殖培地を取り出します。細胞層をCa²⁺/Mg²⁺遊離ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)で徹底的にすすぎ、トリプシンの作用を妨げる可能性のある死細胞、細胞の破片、および血清のすべての痕跡を取り除きます。
   5. 各ディッシュに1.0〜1.5mLのトリプシンEDTA溶液を加えて細胞をトリプシン化し、ディッシュ全体を傾けて溶液を広げ、続いて37°Cで5〜10分間インキュベートします
      手記：倒立顕微鏡で細胞を観察し、実際のトリプシン処理状況を確認します。トリプシン化が不十分な場合、培養皿の表面から剥離する細胞の数が少なくなり、トリプシン化が進むと細胞ストレスが誘発されます。したがって、適切なトリプシン化が重要です。
   6. 各皿に1.0〜1.5mLの完全増殖培地を加えてトリプシンの作用を停止し、その後、穏やかにピペッティングして細胞を再懸濁します
      手記：細胞の健康を維持するためには、穏やかなピペッティングが重要です。
   7. 細胞懸濁液を15 mLのコニカルチューブに集め、室温で250 x gで5分間遠心します。
   8. 上清を取り除いた後、細胞ペレットを回収し、ペレットを1x DPBSに再懸濁して細胞を洗浄します。
   9. 細胞懸濁液を250 x gの低速で5分間回転させます。
   10. 500 μLのDPBSを添加し、穏やかなピペッティングで細胞を再懸濁して、シングルセル懸濁液を得ます。
   11. 血球計算盤または自動セルカウンターを使用して細胞をカウントします.
       手記：精度を上げるには、カウントを3回繰り返して平均を取ります。
   12. 最終的な細胞密度が1 x 10⁸細胞/mLになるように容量を調整します。
2. マウス異種移植片を開発するための細胞の皮下注射
   手記：すべての手順は、BSL2安全キャビネットで行う必要があります。Athymic Nude Foxn1^nu/Foxn¹⁺ マウスは、現在の研究で使用されています。
   1. 50 μLの細胞懸濁液を1.5 mLチューブに取り、50 μLの基底膜マトリックス培地と混合します
      手記：基底膜マトリックス培地は、室温でゲル状の状態を形成する傾向があるため、細胞とマトリックス培地の混合物を氷上で慎重に維持します。チューブ、チップ、シリンジは冷蔵庫に保管し、動物注射の前に氷の上に移すことをお勧めします。
   2. 細胞の凝集を避けるために、混合物を攪拌します。次に、この100 μLの細胞懸濁液-マトリックス培地混合物(5 x 10⁶細胞を含む)を1 ccシリンジに入れます。
   3. 動物の皮膚をそっと持ち上げて皮膚を下の筋肉層から分離し、細胞懸濁液(100μL)を皮膚(5 x 10⁶細胞)の下に26Gの針でゆっくりと注入します。針を抜く前に数秒待ってから、地下マトリックス培地が皮膚の下の細胞とともに半固体のゲル状構造を形成し、混合物が注射部位から出てくるのを防ぎます
      手記：免疫不全マウスに害を及ぼす可能性のある汚染について、注入前に細胞を試験する必要があります。注射中は、針を皮膚の奥深くに置きすぎると、予想以上に深い腫瘍が形成される可能性があります。
   4. 動物を滅菌ケージに入れ、約20分間観察します。
   5. マウスを2〜3週間観察し、腫瘍が最大500 mm³のサイズまで成長するのを待ちます。

4. in vivoイメージングシステムによる抗体局在

>注:この実験で使用された生体内イメージング装置(材料の表を参照)は、生体内の細胞および遺伝的活動の非侵襲的な視覚化と追跡のための一連の高効率フィルターとスペクトルアンミキシングアルゴリズムを使用しています。このシステムは、蛍光と生物発光の両方のモニタリング機能を提供します。

1. 25 μgの色素標識抗体を尾静脈から注入します。
   1. 2%イソフルランを使用して担がんマウスに麻酔をかけます。ペダル反射に対する反応の欠如を確認してください。
   2. マウスの動きが止まったら、ワーム水を適用して外側尾静脈を拡張します。
   3. 26Gの針が付いた1ccのインスリン注射器を使用して、25μg(100μL中)の標識抗体を注入します。
   4. 同様に、ネガティブコントロールとして、がん細胞を標的としない非特異的なIgG1アイソタイプ抗体を標識して注入します。
2. 抗体注入の8、24、48時間後などにin vivoライブイメージングを行います。
   1. 関連するソフトウェアで、コントロールパネルにある[初期化]をクリックし、ステージの温度が37°Cであることを確認します。
   2. 酸素供給、麻酔システムのすべてのポンプ、麻酔チャンバーへのイソフルランガス供給をオンにし、イソフルラン気化器バルブを2%に設定します。
   3. マウスを麻酔室に移し、マウスが完全に麻酔されるまで待ちます。目の乾燥を避けるために、目の潤滑軟膏を塗布します。
   4. コントロールパネルに進み、イメージングウィザードオプションで蛍光イメージングを設定し、773 nmでの励起と792 nmでの発光を選択します。
      手記： デフォルトの自動露出設定では、良好な蛍光画像が得られます。ただし、自動露出の設定は必要に応じて変更できます。
   5. 麻酔をかけたマウスをイメージングチャンバーに移し、ノーズコーンを用いてイメージングフィールドに組み立てます。イメージングステージには、一度に5匹のマウスを収容するオプションがあります.
      手記：分析中に、テストマウスとテストマウスを同程度の曝露量と他の設定を持つように、コントロールマウスを画像化します。
   6. すべての準備ができたら、画像取得のコントロールパネルで[取得]オプションを選択します。
   7. 自動露出設定では、システムは1分以内に画像を生成します。生成された画像は、写真画像上の蛍光のオーバーレイであり、光学蛍光強度はカウントまたは光子の単位または効率の項で表示されます。
   8. 画像を取得した後、マウスをイメージングチャンバーからケージに戻し、1〜2分間回復を観察します。
3. 画像解析用のソフトウェアに用意されているツールと機能を使用して、画像をさらに微調整します。画像解析ツールは、メニューバーとツールパレットにあります。
   1. 「画像調整」で、明るさ、コントラスト、または不透明度を調整し、カラースケールを選択します。
   2. ROIツールを使用して、光学画像内の関心領域(ROI)を指定し、ROI内の信号強度を測定します。必要に応じて、定量化された信号データをスプレッドシート ソフトウェアにエクスポートし、データをプロットします。
   3. フォローアップ研究では、さまざまな組織(肝臓、肺、心臓、腎臓、脾臓、脳など)のマウス剖検を並べて解析し、蛍光標識抗体の詳細な非特異的分布を確認します
      手記：データは、96ウェルアッセイの抗原(この場合はFOLR1)を利用することにより、組織特異的ELISAでさらにサポートできます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
FreeStyle CHO メディア	ギブコライフテクノロジーズ	カタログ番号 # 12651-014
アンチアンチ(100X)	ギブコライフテクノロジーズ	カタログ番号 # 15240-062
凝集防止剤	ギブコライフテクノロジーズ	カタログ番号 # 01-0057DG
BDインスリンシリンジ	BDバイオサイエンス	カタログ番号 #329420
キャリパーIVISスペクトラム	パーキンエルマー	ネコ #124262
CHO CDエフィシェントフィードB	ギブコライフテクノロジーズ	ネコ #A10240-01
Corning 500 mL DMEM (ダルベッコ改変イーグルスミディアム)	コーニング	カタログ番号 # 10-13-CV
コーニング 500 mL RPMI 1640	コーニング	カタログ番号 # 10-040-CV
Cy5標識抗ヒトIgG(H + L)	ジャクソン免疫研究	カタログ番号 # 709-175-149
GlutaMax-I (100倍)	ギブコライフテクノロジーズ	カタログ番号 # 35050-061
HiPureプラスミドMaxiprepキット	インビトゲン	カタログ番号 # K21007
HiTrap MabSelect SuReカラム	GEヘルスケア	カタログ番号 # 11-0034-93
煎じ薬	タカラバイオサイエンス	STO344
IRDye 800CW NHSエステル	リコー	カタログ番号 # 929-70020
イソフルラン、USP	コトラス	カタログ番号 # 11695-6777-2
潤滑剤眼軟膏	リフレッシュラクリルーブ	ネコ #4089
マトリゲル	コーニング	ネコ # 354234
PEIトランスフェクション試薬	サーモフィッシャー	ネコ # BMS1003A
Slide-A-Lyzer透析カセット	サーモサイエンティフィック	ネコ # 66333
Steritop真空フィルター	ミリポアエクスプレス	猫 #S2GPT02RE
トリプシン-EDTA	ギブコライフテクノロジーズ	カタログ番号 # 15400-054
実験モデル:細胞株
人間:OVCAR-3	アメリカンタイプカルチャーコレクション	ATCC HTB-161
ヒト:CHO-K細胞	私たちの研究室で安定した形質転換	ATCC CCL-61
マウス:4T1	UVAのチップ・ランデン博士からの親切な贈り物
マウス:MC38	UMBCのスザンヌ・オストランド・ローゼンバーグ博士からの親切な贈り物	STR プロファイリングによる認証
マウス:MC38 hFOLR1	当研究室で生成(本論文)
実験モデル:動物
マウス:athymic Nude Foxn1nu/Foxn1+	エンビゴ	複数の注文
マウス:NOD.Cg Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ	ジャクソン研究所	複数の注文