結核菌感染マクロファージ亜集団のフローサイトメトリー染色

要約

出典:Mily, A., et al. Polarization of M1 and M2 Human Monocyte-Derived Cells and Analysis with Flow Cytometry upon Mycobacterium tuberculosis Infection. J. Vis. Exp. (2020)

このビデオでは、マルチカラーパネルを使用して細胞の生存率と特定の蛍光標識抗ヒト抗体マーカーを解析するフローサイトメトリーゲーティング戦略を紹介しています。このアプローチにより、結核菌に感染した細胞集団の割合を正確に決定することが可能になります。

プロトコル

1. Mtb感染単球由来細胞のフローサイトメトリー染色

>注:次の手順はBSL-3施設で実行する必要があります。フローサイトメトリー染色は、チューブの代わりに96ウェルプレートで行うことができます。

1. 結核菌、Mtb感染細胞(および非感染コントロール)を6ウェルプレートのウェルから剥離し、ウェルあたり1 mLのFACSバッファーと37°Cおよび5%_CO2で少なくとも30分間インキュベートします。
2. 細胞が剥がれていることを確認するために、数回ゆっくりとピペットで上下させます。可能であれば、顕微鏡で細胞の剥離を確認してください。各ウェルから細胞懸濁液をスクリューキャップ付き微量遠心チューブに移し、チューブを200 x gで5分間回転させます。ピペッティングで上清を慎重に捨てます。
3. 各チューブ内の細胞ペレットをFACSバッファーで2回洗浄し、細胞を200 x gで5分間遠心します。
4. TLR2 (AF647)、CD206 (APC-Cy7)、CD163 (BV605)、CD80 (BV650)、CCR7 (BV711)、CD86 (BV786)、CD200R (PE)、CD64 (PE-Dazzle 594)、HLA-DR (PE-Cy5) (表 1) を含む蛍光色素結合抗ヒト抗体の約 50 μL カクテルで、細胞 (約 0.5 x 10 6 細胞/チューブ) を、生存率色素 Zombie-UV と組み合わせて、暗所で 4 °C (冷蔵庫) で 30 分間染色します。
5. 染色した細胞を400μLのFACSバッファーで2回洗浄し、細胞を200 x gで5分間遠心します。
6. 染色した細胞を200 μLの固定緩衝液(調製済み)で暗所RTで30分間固定し、マイコバクテリアが完全に不活性化されるようにします。
7. 細胞を400μLのFACSバッファーで2回洗浄し、200 x gで5分間遠心して、余分な固定バッファーを除去します。
8. 固定細胞を400 μLのFACSバッファーに再懸濁し、サンプルを新しい1 mL微量遠心チューブに移してから、BSL-3ラボから取り出してBSL-2のフローサイトメトリーに取り出します。染色した細胞をサンプル取得まで+4°Cで保存してください.
   手記： BSL-3実験室から取り出す前に、チューブに70%エタノールをスプレーします。ホルムアルデヒドは毒性(発がん性)であり、クラスIIのバイオセーフティキャビネットで取り扱う必要があります。ホルムアルデヒド廃棄物は別の化学廃棄物に捨てます。

>2. Mtb感染単球由来細胞のフローサイトメトリーデータ取得と解析

>注:ステップ2.1〜2.2は、上記のフローサイトメトリー染色の前に実行する必要があります。細胞凝集や細胞固定後のタンデム色素の解離の問題を回避するため、一次抗体染色後4〜10時間以内に、Mtb感染細胞と非感染細胞の両方のサンプル取得を行います。

1. 上記のフローサイトメトリー染色の前に、染色パネル(表1)にリストされている各蛍光色素標識抗体の蛍光シグナルを、コンペンセーションビーズ(ポジティブとネガティブの両方)を使用してコンペンセーションします。
2. ヒトマクロファージの染色のために抗体希釈液を滴定し、各蛍光色素に最適なシグナルを得ます。
3. 未染色の細胞を使用して、ネガティブな細胞集団のゲートを設定するために必要なバックグラウンド蛍光のレベルを決定し、染色された細胞を可視化することができます(マクロファージは高い自己蛍光性を持っています)。
4. フローサイトメーターで最低50,000細胞/サンプルを、データ取得に推奨されるソフトウェアを使用して取得します。
5. フローサイトメーターから取得ファイルをフローサイトメトリー標準(FCS)形式3.1でエクスポートします。
6. フローサイトメトリー解析ソフトウェアでFCSファイルを解析します。
7. マクロファージは、その前方散乱および側方散乱(FSCおよびSSC)特性に従ってゲートし、Zombie-UV生存率色素を用いた生細胞/死細胞ゲーティングにより死細胞を除外します。
8. H37Rv-GFPに感染したマクロファージをFITCチャネルで可視化します。
9. 陽性染色した細胞の頻度と、すべてのマーカーの幾何平均蛍光強度(MFI)を特定します(表1)。

>表1:フローサイトメトリーに使用される抗体のリスト。

名 の の 名 の の 名 の 名 の 名 名 の 名 名 の 名 の 名 の 名

レーザー	フィルター	蛍光色素	表現型	機能	クローン	カタログ番号	会社
639	670/30	AF647	TLR2	病原体認識受容体	TL2.1	309714	バイオレジェンド
639	780/60	APC-Cy7	CD206	マンノース受容体	15-2	321120	バイオレジェンド
405	610/20	BV605	CD163	スカベンジャー受容体	GHI/61	333616	バイオレジェンド
405	670/30	BV650	CD80	共刺激分子	10日間2日	305227	バイオレジェンド
405	710/50	BV711	CCR7	ケモカイン受容体	G043H7	353228	バイオレジェンド
405	780/60	BV785	CD86	共刺激分子	IT2.2	305442	バイオレジェンド
488	530/30	GFPの	MTBの	細胞内細菌
561	586/15	PE	CD200Rの	抑制性受容体	OX-108	329306	バイオレジェンド
561	14分の620	PE /ダズル594	CD64	IgGのFcガンマ受容体-I	10.1	305032	バイオレジェンド
561	661/20	PE-Cy5 (PC5)	HLA-DR	MHCクラスII分子	L243	307608	バイオレジェンド
355	450/50	BUV395	生存率染料	生/死細胞マーカー	ゾンビUV	423108	インビトゲン

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ホルムアルデヒド	シグマ・アルドリッチ	F8775
ヤギ抗マウスIgG Alexa Fluor 594二次抗体	インビトゲン	R37121	CD64の二次抗体
ヤギ抗ウサギIgG Alexa Fluor 594二次抗体		A-11037	CD163の二次抗体
ウシ胎児血清(FBS)	シグマ・アルドリッチ	F7524
EDTA(0.5メートル)	カロリンスカ大学病院、ハッディンゲ	該当なし
BDコンプビーズプラス	BDの	560497