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方法論記事

サイトカイン誘導キラー細胞の細胞傷害性能を研究するためのIn vitroアッセイ

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2025年7月8日

この記事について

要約

出典:Hsiao, C. H., et al. Isolation and Expansion of Cytotoxic Cytokine-induced Killer T Cells for Cancer Treatment. J. Vis. Exp. (2020).

このビデオは、がん細胞に対するサイトカイン誘導キラー(CIK)細胞の細胞傷害能力を測定するin vitro技術を示しています。標的がん細胞とCIK細胞を共培養すると、死んだがん細胞を蛍光生存率色素を用いて同定し、フローサイトメトリーを用いて定量することで、CIK細胞の細胞傷害効果を推定します。

プロトコル

人間の福祉に関する制度的、国内的、国際的なガイドラインに準拠して実施され、地元の施設審査委員会によって審査されています。

1. 材料の準備

  1. 試薬、抗体、および化学物質は、製品安全データシート(MSDS)に示されているとおりに保管してください。薬物またはサイトカインをストック溶液として溶媒に溶解し、-20°Cまたは-80°Cで保存するために分注します
    手記： 材料の準備の詳細については、材料の表に記載されています。

>2. 末梢血単核細胞(PBMC)の単離

  1. 密度勾配溶液(材料表)を18〜20°Cに温めてから使用してください。溶液ボトルを数回反転させて、完全に混合します。
  2. ヘパリン処理されたバイアルに3〜5 mLのヒト静脈血サンプルを採取し、チューブを数回穏やかに反転させてよく混合します。
  3. 15 mLの滅菌チューブに4 mLの密度勾配溶液を調製します。
  4. 1 mLの血液サンプルを密度勾配溶液に慎重に重ねます。
  5. 400 x gで18-20°Cで30分間遠心分離します(ブレークをオフにします)。
  6. 単核細胞のバフィーコート層(約1mL)を一度に慎重かつ迅速に吸引し、1mLの滅菌ピペットを使用して滅菌15mLチューブに層を乱さないようにします。
  7. 少なくとも3容量(~3 mL)のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を遠心分離チューブのバフィーコートに加えます。滅菌ピペットで細胞を少なくとも3回ピペッティングして、細胞を静かに上下させて懸濁します。
  8. 400 x gで18-20°Cで10分間遠心分離し、上清を吸引します。
  9. 細胞ペレットを5 mLの基礎培地(Table of Materials)で懸濁し、フラスコに移します。細胞培養インキュベーターで細胞を37°Cおよび5%CO2で培養します。

3. CIKの誘導と展開

  1. 0日目に、PBMC(1 x 106)を1,000 IU/mLのIFN-γを含む新鮮な基礎培地で、加湿細胞培養インキュベーターで37°C、5%CO2で24時間培養します。
  2. 1日目は、50 ng/mLの抗CD3抗体、1 ng/mLの組換えヒト(rh)IL-1α、および1,000 U/mLのrh IL-2を含む新鮮な基礎培地で培地をリフレッシュします。3日ごとにミディアムをリフレッシュしてください。
  3. 7日目に、1,000 U/mLのrh IL-2を含む新鮮な基礎培地で培地をリフレッシュします。細胞増殖が終了するまで、3日ごとに培地をリフレッシュします(14日目)。

>4. CIK細胞評価のためのイムノフェノタイピング

  1. CIK細胞を10 mLの滅菌PBSで洗浄します。300 x g、18-20°Cで10分間遠心分離し、上清を吸引し、10 mLのPBSで細胞を再懸濁します。細胞数をカウントし、トリパンブルー排除アッセイを使用して細胞生存率をテストします。
  2. CIK細胞を6本の滅菌済み1.5 mLチューブに分注し、密度は~5–10 x 105細胞/mL PBSです。ラベルを貼り、次のように扱います:チューブ1、ブランク(抗体なし);チューブ2に、アイソタイプIgG1-FITCを20 μL加えます。チューブ3に、アイソタイプIgG1-APC mAbを20 μL加えます。チューブ4に、20μLのCD3-FITCを加えます。チューブ5に20 μLのCD56-APC mAbを添加します。チューブ6に20 μLのCD3-FITCと20 μLのCD56-APC mAbを添加します。
  3. 1 mLの滅菌ピペットでCIK細胞を少なくとも3回ピペッティングして抗体と静かに混合し、暗所で室温で30分間インキュベー
    4. トします。
  4. チューブを300 x gおよび18-20°Cで10分間遠心分離し、上清を吸引し、細胞ペレットを1 mLのPBSで1回懸濁します。1mLの滅菌ピペットで少なくとも3回、静かに上下させます。
  5. 手順4.4を繰り返します。
  6. フローサイトメトリー解析の前に、チューブを暗闇に置いておきます。

5. CDマーカー認識

  1. 細胞懸濁液を、細胞ストレーナーキャップ(100 μmメッシュ)付きの滅菌済み5 mLポリスチレン丸底チューブに移し、キャップを静かにピペッティングします。チューブをカルーセルに順番に置きます。
  2. フローサイトメトリー解析ソフトウェアを開き、実験フォルダを作成します。New Specimen ボタンをクリックして、試験片とチューブを実験に追加し、チューブに次のように名前を付けます。チューブ2、アイソタイプIgG1-CD3;チューブ3、アイソタイプIgG1-CD56;チューブ4、CD3;チューブ5、CD56;チューブ6、CD3CD56。
  3. CIK細胞集団の散布図ゲーティングシステムを作成します(図1A)。
    1. Tube 1 (Blank)を選択し、Dot PlotボタンをクリックしてFSC-A/SSC-Aプロットを作成します。FSC-Aしきい値>5 x 104で細胞集団全体に長方形のゲートを描き、細胞破片を除外します。
    2. 新しいドットプロットのSSC-A/SSC-Hパラメータを選択し、すべての単一セルの周囲にポリゴンゲートを描画します。新しいヒストグラムプロットのCount/FITC (CD3)パラメータとCount/APC (CD56)パラメータをそれぞれ選択します。新しいドットプロットのFITC (CD3)/APC (CD56)パラメータを選択し、4つの部分母集団を定義するための4象限ゲートを描画します。
    3. 各検体の20,000個の単一細胞からのデータを記録します。Load Sampleボタンをクリックして、最初にブランクコントロールサンプルを分析します。CD56およびCD3チャネルパラメータを使用して、CIK細胞集団全体を同定します。
  4. 手順5.3を繰り返して、すべての標本を調査します。
  5. 個々の検体の統計値を含むファイルを開き、CIK細胞集団を解析し、解析ファイルに再印刷します。

6. ヒト慢性骨髄性白血病K562細胞および卵巣がんOC-3細胞の培養と染色

  1. K562セル
    1. K562細胞を完全培地(10%ウシ胎児血清[FBS]と50 U/mL抗生物質を含むRPMI基礎培地)で細胞培養フラスコで0.5-1 x 106細胞/mLの密度で培養し、加湿インキュベーターで37°Cおよび5%CO2でインキュベー
      2. トします。
    2. K562細胞を含む培地を50 mLの滅菌チューブに移し、実験当日に細胞を300 x gで10分間、18-20°Cでペレット
      3. 化します。
    3. 上清を吸引し、細胞を5 mLの滅菌PBSに再懸濁し、穏やかによく混合します。
    4. 細胞を300 x gで10分間ペレット化し、上清を吸引し、細胞をPBSに再懸濁し、K562細胞を0.5-1 x 106細胞/mLの濃度に調整します。
    5. 15 mLの滅菌チューブ中の1 mLのK562細胞懸濁液に0.5 μLのカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル(CFSE)色素を最終濃度5 μMで加えます。懸濁液を少なくとも3回ピペッティングして穏やかに混合します。
    6. チューブを細胞培養インキュベーターに37°C、5%CO2で10〜15分間放置します。
    7. 9 mLのPBSをチューブに加え、細胞を300 x gで10分間ペレット化し、上清をデカントし、細胞ペレットを10 mLの完全培地に懸濁します。細胞懸濁液を細胞培養フラスコに移し、インキュベーターに入れます。
  2. OC-3 セル
    1. OC-3細胞を完全培地(10%FBSと50U/mL抗生物質を含むDMEM/F12培地)で、密度0.5–1 x 106細胞、37°C、5%CO2の細胞培養フラスコでOC-3細胞を培養します。
    2. 実験の1日前に培地を吸引し、細胞をPBSで洗浄します。
    3. 1 mLの細胞解離酵素溶液(Table of Materials)を加えて細胞を剥離し、37°Cで5分間インキュベー
      4. トします。
    4. PBSを5mL加えて細胞を懸濁し、よく穏やかに混合します。細胞を300 x gで10分間ペレット化し、上清を吸引します。細胞をPBSに再懸濁し、細胞を0.5〜1 x 106細胞/mLの濃度に調整します。
    5. 15 mL滅菌チューブ中のOC-3細胞懸濁液1 mLに0.5 μLのCFSE色素を最終濃度5 μMで加え、懸濁液を少なくとも3回ピペッティングして穏やかに混合します。
    6. チューブを細胞培養インキュベーターに37°C、5%CO2で10〜15分間放置します。
    7. 9 mLのPBSをチューブに加え、細胞を300 x gで10分間ペレット化します。5 x 105細胞/ウェルを6ウェルプレートに播種し、加湿インキュベーターで37°Cおよび5%CO2で一晩インキュベー
      8. トします。

7. 細胞毒性アッセイ

  1. CIK細胞とK562細胞の共培養(CIK-K562)
    1. ステップ6.1.7からK562細胞をカウントし、トリパンブルー排除アッセイにより細胞生存率をテストします。1 mLのK562細胞を6ウェルプレートの各ウェルに5 x 105/mLの密度で加えます。
    2. ステップ3.4のCIK細胞の有無にかかわらず、1 mLの基礎培地をステップ7.1.1の6ウェルプレートに次のように加えます:ウェル1 = ブランク、K562細胞のみ(5 x 105)。ウェル 2 = CFSE 染色 K562 細胞のみ (5 x 105);ウェル 3 = CIK 細胞 (E [エフェクター], 25 x 105) + CFSE 染色 K562 細胞 (T [ターゲット], 5 x 105);ウェル 4 = CIK 細胞 (E, 50 x 105) + CFSE 染色 K562 細胞 (T, 5 x 105)。
    3. 細胞懸濁液を少なくとも3回ピペッティングして静かにピペッティングして混合し、プレートをインキュベーターに24時間置きます。
  2. CIK細胞とOC-3細胞の共培養(CIK-OC-3)
    1. ステップ 3.4 の CIK 細胞の有無にかかわらず、1 mL の基礎培地をステップ 6.2.7 の 6 ウェルプレートに次のように追加します: ウェル 1 = ブランク、OC-3 細胞のみ (5 x 105);ウェル 2 = CFSE 染色 OC-3 細胞のみ (5 x 105);ウェル 3 = CIK 細胞 (E, 25 x 105) + CFSE 染色 OC-3 細胞 (T, 5 x 105);ウェル 4 = CIK 細胞 (E, 50 x 105) + CFSE 染色 OC-3 細胞 (T, 5 x 105)。
    2. 細胞懸濁液を少なくとも3回、静かにピペッティングして混合し、プレートをインキュベーターに24時間入れます。
  3. 7-アミノアクチノマイシンD(7-AAD)色素染色
    1. ステップ7.1.3のCIK-K562細胞懸濁液を15 mLの滅菌チューブに直接回収します。
    2. ステップ7.2.2からCIK-OC-3グループから懸濁細胞と接着細胞の両方を採取します。
      1. 細胞懸濁液を15 mLの滅菌チューブに移します。滅菌PBS1 mLでウェルを洗浄し、PBSを回収してチューブに加えます。0.5 mLの細胞解離酵素溶液を加え、37°Cで5分間インキュベー
        2. トします。
      2. 同じチューブから1 mLの溶液を対応するウェルに加え、1 mLの滅菌ピペットで細胞を少なくとも3回ピペッティングして細胞を穏やかに混合します。すべての細胞を同じチューブに集めます。
    3. 300 x gで10分間遠心分離し、上清を吸引し、細胞を1 mLの滅菌PBSに再懸濁します。細胞を300 x gで10分間ペレット化し、上清を吸引し、細胞を100 μLの滅菌PBSに再懸濁します。
    4. 5 μL の 7-AAD 色素 (ストック量 50 ng/μL) を細胞懸濁液に加えます。1 mLの滅菌ピペットで細胞を少なくとも3回上下させて、細胞を穏やかに混合します。10分間インキュベートし、分析する前に暗所に置いておきます。
  4. 細胞溶解能力アッセイ
    1. ステップ7.3.4の細胞懸濁液を混合し、ステップ5.1と5.2を1回繰り返します。
    2. New Specimen ボタンをクリックして、実験に試料とチューブを追加し、チューブに次のように名前を付けます: Tube 1, K562 (or OC-3) cells only;チューブ 2、CFSE 染色 K562 (または OC-3) 細胞のみ。チューブ 3、E:T = 5:1;チューブ 4、E:T = 10:1。
    3. 細胞溶解アッセイ用の散乱ゲートシステムを作成します(図2A)。
      1. Tube 1を選択し、Dot PlotボタンをクリックしてFSC-A/SSC-Aプロットを作成します。FSC-Aしきい値>5 x 104のすべてのイベントに長方形のゲートを描画して、セルデブリを除外します。
      2. 新しいドットプロットのSSC-A/CFSEパラメータを選択します。新しいドット プロットの 7-AAD/CFSE パラメーターを選択し、4 つのサブ母集団を定義するための 4 象限ゲートを描画します。
      3. Load Sampleボタンをクリックして、最初にブランクのコントロールサンプルを解析します。
      4. 電圧を調整しますtagSSC-AとFSC-Aの。CFSEおよび7-AADチャネルパラメータを使用して、死細胞集団を同定します。各検体中の>20,000個のCFSE+細胞のデータを記録します。
    4. すべての標本の調査について、セクション7.4.6を繰り返します。
    5. 個々の検体の統計値を含むファイルを開き、生存不能な細胞集団を分析し、データを分析ファイルにエクスポートします。

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結果

figure-results-1
図1:代表的なPBMCサンプルからのCD3+CD56+ T細胞の割合。 (A)リンパ球は、特定のサイズと粒度によって認識されました。フローサイトメトリーによる解析のために選択された単一細胞集団。(B)健常ドナー3名によるCIK拡大効果の統計解析をt検定(*, p < 0.01)を用いて行いました。

figure-results-2
図2:ヒト慢性骨髄性白血病K562およびヒト卵巣がんOC-3細胞に対するCIK細胞の細胞傷害性効果。

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開示事項

利益相反は宣言されていません。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
7-アミノアクチノマイシンDBDの559925
APCマウス抗ヒトCD56抗体BDの555518B159
APCマウスIgG1、κアイソタイプコントロールBDの555751MOPC-21
BD FACSCanto II フローサイトメーターBDの338962SN:R33896202856
カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル(CFSE)BDの565082CFSE 色素 (500 mg) と 90 mL の DMSO による再構成
D-(+)-グルコース溶液シグマG8644K562細胞培養用。12.5 mL から 500 mL の完全培地を添加
ダルベッコ モディファイドイーグル ミディアム/F12ハイクローン02 SH30023OC-3細胞培養用基礎培地
ウシ胎児血清ハイクローン03 SH30084月K562およびOC-3細胞培養用。完全な培地にはFBSが10%含まれています
フィコール・パケ・プラスGEヘルスケアライフサイエンス71101700 - EK密度勾配ソリューション
FITCマウス抗ヒトCD3抗体BDの555332UCHT1
FITCマウスIgG1、κアイソタイプコントロールBDの555748MOPC-21
ヒト抗CD3 mAbタカラT210OKT32.5 mLのストック(1 mg / 1 mL)を50 mLの誘導培地に加えます。.-80°Cでの保管ストック
ペニシリン-ストレプトマイシンギブコ151401225 mLのストック(10,000 U / mL)を500 mLの完全培地に加えます。4°Cでの保管ストック。
プロロイキンノバルティスプロロイキン粉末(22x106 IU)を1.2 mLの滅菌水で再構成し、2.7 mLを50 mLの誘導培地に加えます。-20°Cでの保管ストック
組換えヒトインターフェロン-γセルジェニックス1425-050rh IFN-g (5x105 IU/50 μg) を 200 μL の滅菌水で再構成し、20 mL を 50 mL の誘導培地に加えます。-20°Cでの保管ストック
組換えヒトインターロイキン-1アルファペプロテック200-01Arh IL-1α (10 μg) を 1 mL の滅菌水で再構成し、5 mL から 50 mL の誘導培地を加えます。-20°Cでの保管ストック
RPMI1640ミディアムギブコ11875-085K562細胞培養用の基礎培地。4°Cでの保管ストック
シグマ3-18K遠心分離機シグマ10295
TrypLE発現酵素ギブコ12605028細胞解離酵素;接着細胞の接着解除に。室温での保存
X-VIVO 15 ミディアムロンザ04-418QPBMC細胞およびCIK細胞の基礎培地。4°Cでの保存
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