ヒト上皮腸質モデルにおける壊死性腸炎の誘発

Abstract

出典:Ares, G. J., et al. 壊死性腸炎の新規ヒト上皮腸様モデル。J. Vis. Exp.(2019年)。

このビデオは、リポ多糖類治療によって誘発されるヒト由来の新生児腸内モデルにおける壊死性腸炎疾患の発症を示しています。このモデルは、腸の病態生理学を研究するのに役立ちます。

Protocol

人間の福祉に関する制度的、国内的、国際的なガイドラインに準拠して実施され、地元の施設審査委員会によって審査されています。

1. 試薬の調製

1. 全組織コレクション用の培地ストック溶液を調製します:ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)1 L、ウシ胎児血清(FBS)110 mL、ペニシリン-ストレプトマイシン11 mL(最終濃度1%)、およびフィルター滅菌インスリン1.1 mL(最終濃度0.1%)。原液は4°Cで保存してください。
2. キレートバッファー#1を調製:30 mLの培地(1.1に記載)、600 μLの0.5 Mエチレンジアミン四酢酸(EDTA)(最終濃度10 mM)、300 μLのゲンタマイシン(最終濃度1%)、および60 μLのアムホテリシンB(最終濃度0.2%)を調製します。原液は4°Cで保存してください。
3. キレートバッファー#2を調製します:30 mLの培地(1.1に記載)、300 μLの0.5 M EDTA(最終濃度5 mM)、300 μLのゲンタマイシン(最終濃度1%)、および60 μLのアムホテリシンB(最終濃度0.2%)。原液は4°Cで保存してください。
4. ヒトミニ腸培地を調製する:41.4 mLのDMEM / F-12、5 mLのFBS(最終10%)、500 μLのペニシリン-ストレプトマイシン(最終濃度1%)、500 μLのL-グルタミン(最終濃度1%)、500 μLのゲンタマイシン(最終濃度1%)、100 μLのアムホテリシンB(最終濃度0.2%)、500 μLの1 M N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N-2-エタンスルホン酸(HEPES)(最終濃度10 mM)、 100x N-2サプリメント500 μL、および50x B-27サプリメント1 mLからビタミンAを差し引いた合計容量50 mL。原液は-20°Cで保存してください。
5. ヒトMinigut培地の調製完了:10 mLのHuman Minigut培地(1.4で調製)、10 μLの100 μg/mL Wnt3a(最終濃度100 ng / mL)、10 μLの100 μg / mL Noggin(最終濃度100 ng / mL)、10 μLの1 mg / mL R-Spondin(最終濃度1 μg / mL)、 上皮成長因子(EGF)10μL(最終濃度50ng/mL)、10μLの1M N-アセチルシステイン(最終濃度1mM)、10μLの10mM Y-27632(最終濃度10μM)、500μMのA-83(最終濃度500nM)10μL、10mM SB202190 10μL(最終濃度10μM)、 100 μL の 1 M ニコチンアミド (最終濃度 10 mM) および 100 μM [leu] 15-ガストリン 1 (最終濃度 10 nM) の 1 μL総容量10mL。原液は4°C.
   で保存してください。 手記： ソリューションは48時間以内に使用する必要があります。

2. 全組織からの陰窩の分離とプレーティング

1. 手術室での採取時には、ヒトの小腸組織サンプルを冷たいダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)に入れます。便や血液がなくなるまで、検体を冷たいDPBSで洗います。試料は、クリプトアイソレーションの準備ができるまで、RPMI 1640 Mediumで4°Cで保存します。
   手記：ティッシュは24時間以上保存できません。
   1. 検体に便や血液が付着していないことを確認してください。繊細な解剖ハサミを使用して、余分な脂肪や外科用クリップ/ステープルなどを取り除きます。試験片の重量を量ります.
      注:約0.75〜2.5gのピースを目安
   にしてください。
2. 試料を0.5 cmに切り、30 mLのキレートバッファー#1(ステップ1.2で調製)に入れます。
   1. 4°Cで15分間低速で振とうします。
   2. 100 μmのセルストレーナーで組織をろ過し、フロースルーを廃棄します。
3. 組織を30 mLのChelating Buffer #2(ステップ1.3で調製)に加えます。
   1. 4°Cで15分間低速で振とうします。
   2. 100 μmのセルストレーナーで組織をろ過し、フロースルーを廃棄します。
4. ステップ2.8で使用するために、500 mLの基底膜マトリックスを氷上で解凍します。
5. 50 mLのコニカルチューブに入った10 mLの冷たいDMEMにティッシュを加え、手で10秒間激しく振とうします。
   1. 100 μmのセルストレーナーでろ過し、フロースルーを収集します(ラベル#1)。チューブ#1を氷の上に保ちます。
   2. 別の50 mLコニカルチューブ内の別の10 mLの冷たいDMEMにティッシュを加え、手で10秒間激しく振とうします。.
   3. 100 μmのセルストレーナーでろ過し、フロースルーを収集します(ラベル#2)。
   4. フロースルーの円錐形チューブが4本できるまで、さらに2回繰り返します(チューブ#1-4とラベル付けされています)。
6. フィルターチューブ#1溶液を100μmのセルストレーナーに通し、15mLのコニカルチューブ(ラベル#1)に流し替えます。#2-4についても繰り返します。
   1. 15 mLチューブ#1-4を200 x gで4°C、15分間遠心分離します。
7. 層流フードで、チューブ#1-4から上清を取り除き、廃棄します。ペレットのすぐ上の組織の雲を乱すことは、たとえそれが上清を残すことを意味するとしても避けてください。
   1. ゆっくりとピペッティングして、ペレットと残った上清をチューブ#1-4に混ぜ合わせます。
   2. チューブ#1-4から混合物を1本の2 mLコニカルチューブに移します。
   3. コニカルチューブを200 x gで4°Cで20分間遠心分離します。
8. 上清を取り除き、ペレットを基底膜マトリックスの500μLに再懸濁します><。 手記：基底膜マトリックスを常に氷上に保ち、次のステップに迅速に取り組みます。本製品は、室温で非常に迅速に重合します。
   1. 50 μLの試料/基底膜マトリックス懸濁液を24ウェルプレートのウェルの中央に塗布します。これはドーム型に見えるはずです.
      手記： チルドピペットチップを使用すると、懸濁液の移し替えがスムーズになり、重合が最小限に抑えられます。
   2. 9回繰り返して、合計10個のウェルを充填します。
9. 24ウェルプレートを37°C、5%CO2インキュベーターに30分間置き、重合させます。
10. 500 μLのHuman Minigut Media Complete(ステップ1.5で調製)を各ウェルに加えます。2日ごとに交換してください。
11. 出芽が視覚化される5〜10日後にエンテロイドを採取します。収集手順については、ステップ 4 と 5 を参照してください。

3. NEC実験の誘導

1. 0日目に、5 mg/mLのリポ多糖(LPS)10 μLを、各ウェルのHuman Minigut Media Complete(ステップ1.5で調製)500 μLに加えます。収集まで2日ごとに交換してください。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% パラホルムアルデヒド	サーモフィッシャー	AAJ19943K2
基底膜マトリックス(マトリゲル)	コーニング	CB-40230Cの
DMEM/F-12	サーモフィッシャー	MT-16-405-CV
ダルベッコのモディファイドイーグルミディアム(DMEM)	サーモフィッシャー	11-965-118
ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)	サーモフィッシャー	14190-144
上皮成長因子(EGF)	シグマ	E9644-.2MG
エチレンジアミン四酢酸(EDTA)	シグマ	EDS-500Gの
ウシ胎児血清(FBS)	ジェミニバイオプロ	100〜125
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)	シグマ	P5368-5X10PAK
RPMI 1640 ミディアム	インビトゲン	11875093
ティッシュプロセッシングゲル(Histogel)	サーモフィッシャー	22-110-678
リポ多糖類(LPS)	シグマ	L2630-25MG
ゲンタマイシン	シグマ	G5013-1Gの