がん細胞の好中球細胞外トラップへの付着を検出するためのin vitro接着アッセイ

要約

Najmeh, S., et al.簡略化されたヒト好中球細胞外トラップ(NET)の分離と取り扱い。J. Vis. Exp.(2015年)

このビデオでは、蛍光顕微鏡を使用してがん細胞の好中球細胞外トラップ(NET)への付着を検出するアッセイを実演しています。試験ウェルでは、NETsに付着する蛍光標識がん細胞の数が顕著に増加していますが、DNaseで処理されたウェルでは、NETsへのがん細胞の接着が減少しています。

プロトコル

1. NET-がん細胞静電接着アッセイ

1. 96ウェルの平底板にウェルあたり100μlのNETストックを加え、暗所でウェルO/Nを4°Cでコーティングします。
2. 12時間から20時間後の間に、顕微鏡下でウェルの底に無細胞NETの均一な単層が形成されることを確認します(図1)。この時点で、底部のNET単層を破壊しないようにしながら、すべての非付着材料をウェルから静かに吸引します。
3. 1%ウシ血清アルブミン(BSA)ブロッキング溶液100 μlを各ウェルに加え、室温で1時間放置します。
4. 2 mLの0.25%トリプシン溶液を使用して、T-75フラスコからA549がん細胞を分離します。.分離したら、10 mLのA549培地をトリプシン処理細胞に加え、450 x g、4°Cで5分間遠心分離します。上清を捨て、培地中の細胞を再懸濁して、培地100μlあたり2 x10⁴がん細胞の濃度を得ます。
   手記：A549細胞は別々に増殖しました。簡単に説明すると、細胞を10%FBSおよび1%ペニシリンストレプトマイシンを含むDMEM F12培地で培養および維持し、37°C5%_CO2でインキュベートしました。細胞のコンフルエンスが70〜80%に達したら、0.25%トリプシン-EDTAを使用して剥離し、上記と同じ培地に再懸濁しました。
5. CFSEを使用してがん細胞を染色するには、培地1 mLあたり1 μlのCFSEを添加し、RTで10分間染色します。染色後、450 x g、4°Cで5分間遠心分離し、上清を捨てて細胞を初期容量の培地に再懸濁すると、培地100 μlあたり2 x10⁴個のがん細胞の濃度が得られます。
6. NETブロッキングを1時間行った後、ブロッキング溶液を穏やかに吸引し、培地中の2 x10⁴がん細胞(100 μl相当)をNET単層に1ウェルあたり追加し、37°Cの5%CO₂で90分間接着させます。細胞を穏やかに吸引し、各ウェルに100 μlのPBSを加えて、非接着性細胞を洗浄します。
7. 一部のウェルでは、洗浄前にウェルあたり1000UのDNAse Iを10分間添加してNETを分解します。これはネガティブコントロールとして機能します。他のウェルでは、ウェルあたり100μlの滅菌水を10分間追加します。これはビヒクル制御(VC)として機能します
   注:通常、サンプルサイズを増やすために、条件ごとに3回の繰り返しが行われます。
8. ウェル内のすべての溶液を吸引して廃棄し、底部にNETと付着がん細胞のみを残します。ウェルあたり100 μlの4%ホルムアルデヒド溶液を添加して、接着がん細胞をNETSに固定し、蛍光顕微鏡でアッセイを読み取ります(図1)。結果をプロットして分析します(図2)。

結果

図 1.NET 単層」を参照してください。NETでコーティングされた96ウェルプレートウェルの光学顕微鏡画像は、(A)ウェル全体に均一なNETの単層があるのに対し、(B)NETの中断された層によるウェルのコーティングが不十分であることを示しています。スケールバーは40μmを表します。

図 2.In vitro 接着アッセイの結果。GraphPadソフトウェアを使用して、A549がん細胞接着アッセイの結果をNETsに...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)、変性、塩化カルシウムおよび塩化マグネシウムなし	ヨーロッパバイソン	311-425-CL
RPMI-1640 L-グルタミン入りミディアム	ヨーロッパバイソン	350-000-CL	3% RPMI溶液は、RPMIに3%ウシ胎児血清を添加して作られ
BD Pharm Lyse Lysing バッファー	BDバイオサイエンス	555899
DNAse1	ロシュ	11284932001
F12 DMEM	ヨーロッパバイソン	319-075-CL
ウシ胎児血清(FBS)	ヨーロッパバイソン	〒080-150
ペニシリン/ストレプトマイシン	ギブコ	15140-122
CFSEの	インビトゲン	C1157
0.25%トリプシン-EDTA	ギブコ	〒25200-056

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