免疫学的研究のための細菌細胞の染色と調製

要約

出典:Yang, J. et al., 宿主細胞への細菌付着の自動ハイスループット検出。J. Vis. Exp. (2021年度)

このビデオでは、赤色蛍光色素を使用した免疫学的研究のための細菌細胞の染色と調製を実演しています。染色された細菌を希釈して増殖培地に再懸濁すると、宿主細胞感染に必要な細菌濃度(感染の多様性を表します)が得られます。

プロトコル

1. 細菌の増殖と染色

1. すべての細菌作業は、バイオセーフティキャビネット、バイオセーフティレベル2の実験室で行ってください。
2. 凍結グリセロールストックから緑膿菌(PAO1)、大腸菌、リステリア菌、枯草菌などを含むすべての細菌培養物を接種し、トリプシン大豆ブロス(TSB、3mL)で37°Cの振とうインキュベーターで250rpmに維持して一晩
増殖させます。
3. 翌日、一晩培養物を1:100に希釈して継代培養液を接種し、TSB(1mL)で指数相まで3時間増殖させ、光学濃度を測定し、ODを600nm(_OD600)で測定して確認します。_OD600が0.4〜0.6の範囲にあることを確認します。
4. 細菌宿主接着アッセイを実施する前に、TSB寒天プレート上に細菌懸濁液の段階希釈液をプレート化し、37°Cで一晩インキュベートした後、コロニー数から細菌コロニー形成単位(CFU)を確立します。緑膿菌の場合、OD₆₀₀ 1.0 は 2 x 10⁸ 生存細菌細胞/mL に相当し、L. monocytogenes の場合、OD₆₀₀ 1.0 は 9 x 10⁸ 生存細菌細胞/mL に相当します。
5. 13,000 x gで室温(RT)で2分間遠心分離することにより、指数関数的な段階で細菌培養物を回収し、1倍リン酸緩衝生理食塩水(PBS 1 mL)を使用して1回洗浄します。細菌ペレットを1 mLの1x PBSに再懸濁し、OD₆₀₀の細菌懸濁液を測定して濃度を測定します。例えば、_OD600が0.5の緑膿菌は、1×10⁸個の細菌細胞/mLの濃度を表す。
6. 緑色または赤色の蛍光色素を使用して、室温で30分間、暗所で穏やかに回転させながら細菌懸濁液を染色します。このためには、500倍濃縮ストック染色色素2 μLを細菌懸濁液1 mLに加え、色素を1倍に希釈します。染色色素を洗い流すには、染色した細菌を13,000 x gで2分間遠心分離し、ペレットを1x PBSの1 mLに再懸濁します
   手記：蛍光-(緑色蛍光タンパク質(GFP-)、赤色蛍光タンパク質(RFP-)、mCherry-など)タグ付き細菌を実験で使用する場合は、この細菌染色ステップをスキップしてください。GFPタグ付き緑膿菌および赤色蛍光色素染色されたL.モノサイトゲネスをこのプロトコールで使用した。
7. 染色した細菌細胞またはGFPタグ付き細菌を13,000 x gで2分間遠心分離して回収し、新鮮なF-12K培地(1 mL)に再懸濁し、各培養物のOD₆₀₀を測定します。その後、感染の多様性(MOI)と宿主細胞の濃度に基づいて、培養物を所望の濃度に希釈します。この実験で使用した最終容量は500μL.
   です 手記：例えば、Trypan Blue染色を使用してカウントした宿主細胞濃度が1 x 10⁵細胞/mLの場合、MOI100での細菌細胞の所望濃度は1 x 10⁷細胞/mLとなります。0.5 OD₆₀₀での緑膿菌の濃度は1 x 10⁸ / mLです。所望の濃度を得るには、緑膿菌培養物を10倍に希釈し、50μLの再懸濁培養物を450μLの新鮮なF-12K培地に加えます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
10倍PBS	VWRの	45001-130
BactoViewライブレッド	ビオチウム	40101	バクテリアスタン染料
遠心機	エッペンドルフ	5810R型
大腸菌			ラボストック
F-12Kミディアム	ATCCの	302004	A549細胞培養培地
ウシ胎児血清	コーニング	35-016-CV
L.モノサイトゲネス			NISTコレクション
OD600 ディルフォトメーター	実装
緑膿菌			ロリ・バロウズ博士の研究室用ストック
緑膿菌 ΔpilA			ロリ・バロウズ博士の研究室用ストック
S.アガラクチアエ			NISTコレクション
黄色ブドウ球菌	BEIの	NR番号-46543
黄色ブドウ球菌 ΔsaeR	BEIの	NRの48164
S.ルビダエア			NISTコレクション
典型的な醤油	グローセル	MBPE-4040