フローサイトメトリーを用いた細菌表面へのビトロネクチン結合の検出

Abstract

出典:Singh, B. et al., Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance.J. Vis. Exp.(2018年)

このビデオは、ビトロネクチンと細菌表面タンパク質との相互作用の検出を示しています。フローサイトメトリー解析では、ビトロネクチンに結合した蛍光標識抗体の蛍光シグナルを測定し、細菌表面での存在を確認します。この手法は、宿主と病原体の相互作用と潜在的な細菌感染治療に関する洞察を提供します。

Protocol

1. 細菌表面タンパク質リガンドとしてのビトロネクチン、Vnの解析

1. フローサイトメトリー
   を用いた細菌表面のVn結合の検出 手記：フローサイトメトリーでは、側方散乱光と前方散乱光を使用して陽性イベントをゲートしました。Vn、インフルエンザ菌f型との相互作用を調べるために、Hif臨床分離株(n = 10)を大腸菌BL21(DE3)とともにネガティブコントロールとして選択しました(図1A)。
   1. 10 μg/mL のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド (NAD) とヘミンを 37 °C で 200 rpm で振とうした脳心注入 (BHI) 培地中の Culture Hif 臨床分離株。Luria-Bertani培地を使用して大腸菌を培養します。中対数相(光学密度、OD₆₀₀ = 0.3)でHifを採取し、1%(w / v)ウシ血清アルブミン(BSA)(ブロッキングバッファー;PBS-BSA)です。懸濁液を10⁹コロニー形成単位(CFU/mL)に調整します。
   2. 5 x 10⁶ CFUを含むアリコートを5 mLポリスチレン丸底チューブ(12 x 75 mm²)に移し、1 mLのブロッキングバッファーを加えます。懸濁液を室温(RT)で3,500 × gで5分間遠心分離し、バクテリアをペレット化した後、ペレットを乱さずに上清を慎重に吸引して除去します。
   3. バクテリアペレットを250 nM Vnを含む50 μLのブロッキングバッファーで再懸濁し、サンプルを振とうせずにRTで1時間インキュベートします。インキュベーション後、細菌を3,500 x gで5分間遠心分離してペレット化し、PBSおよび同様の遠心分離ステップを使用してペレットを3回洗浄します。
   4. バクテリアペレットに、PBS-BSAで1:100の希釈率で50μLの初代ヒツジ抗ヒトVnポリクローナル抗体(pAbs)を加えます。懸濁液を室温で1時間インキュベートし、次いで細菌をPBSで3回洗浄して未結合の抗体を除去する(ステップ1.1.3を参照)。
   5. 次に、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)標識ロバ抗羊pAbs(1:100希釈)を含むPBS-BSA50μLを加え、室温で暗所1時間インキュベー
   トします。
   6. ブロッキングバッファーのみで細菌をインキュベートし、Vnを含まないpAbでインキュベートすることにより、ブランクコントロールを調製します。
   7. 1 mLのブロッキングバッファーで細菌を3回洗浄し、セクション1.1.2で説明されているように、懸濁液を遠心分離によりペレット化します。最後に、細菌ペレットを300 μLのPBSで再懸濁し、フローサイトメトリーで分析します。

Results

図1:インフルエンザ菌血清型fは、表面発現PHを介してVnに結合します。(A)Hif臨床分離株の細胞へのVnの結合を示すフローサイトメトリーの結果。各臨床分離株(5 x 10⁶ CFU)を250 nMのヒトVnとインキュベートしました。結合したリガンドは、ヒツジ抗Vn pAbおよびFITC標識ロバ抗ヒツジ二次抗体を用いて検出した。大腸菌BL21(DE3)をネガティブコントロールとして含めた。データは、3つの別々の実験における三重解析からの平均蛍光強度として表され、エラーバーはSDを表します。(B)WT Hif M10およびPH欠失Hif M10Δlph変異体の表面へのVnの結合を示すフローサイトメトリーヒストグラム。3つ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 mLポリスチレン丸底チューブ	BDファルコン	〒60819-138	12 × 75 mmスタイル
ウシ血清アルブミン(BSA)	シグマ・アルドリッチ	A2058(英語版)	細胞培養に適しています
フローサイトメーター	BDバイオサイエンス	651154	研究アプリケーション向けの細胞解析グレード
ヒト血漿由来のビトロネクチン(Vn)	シグマ・アルドリッチ	V8379-50UG	細胞培養グレード
大腸菌宿主(E.コリBL21)	ノヴァゲン	69450から3	タンパク質発現宿主
FITC標識ロバ抗ヒツジ抗体	AbDセロテック	STAR88F	ポリクローナル
ヒツジの抗ヒトVn抗体	AbDセロテック	AHP396	ポリクローナル