リン酸化フローサイトメトリーを用いた間質性サイトカイン誘導性細胞内タンパク質リン酸化の評価

要約

出典:Coats, J. S., et al. Expression of Exogenous Cytokine in Patient-derived Xenografts via Injection with a Cytokine-transduced Stromal Cell Line. J. Vis. Exp. (123) (2017).

このビデオは、白血病細胞における間質サイトカインによるタンパク質の細胞内リン酸化の評価を示しています。これらの細胞内リン酸化タンパク質は、リン酸化フローサイトメトリー技術を用いて定量されます。

プロトコル

1. Phospho-flow Cytometry Assays to evaluate the activity by Stroma (ストロマが産生するサイトカインの活性を評価するためのリン酸化流サイトメトリーアッセイ)

>注:最初の実験の前に、操作された間質からの上清を評価して、個々の実験に関連する間質生成サイトカインの生物活性を確認してください。改変された間質が検証されたら、新しいベクターで生成された間質が導入されない限り、それ以上のテストは必要ありません。

1. MUTZ5および/またはMHH-CALL4白血病細胞株(TSLP応答性)、組換えヒトサイトカイン、およびリン酸化フローサイトメトリーアッセイでの使用が承認された抗体を購入して、適切な下流のリン酸化ターゲットを検出します。
2. コントロールおよびサイトカイン発現間質から上清を解凍して収穫しました。
3. 白血病細胞株をR20培地(材料表を参照)に、96ウェル組織培養プレートのウェルあたり0.2 x 10⁶細胞の濃度でプレート化します。条件ごとに3ウェルをプレート化し、トリプリケートアッセイを可能にします。37°Cで2時間インキュベートします。この時間により、以前の培養条件で発生したリン酸化の損失が可能になります.
   注:細胞株あたり12ウェルは、ステップ1.4で示された各実験条件に対してトリプリケートアッセイを提供します。
4. 培養で2時間後、各ウェルから細胞を分離4 mLチューブに移し、500 x gで5分間、4°Cで遠心分離します。
   1. 次の実験条件のそれぞれについて、細胞を200 μLに再懸濁します(アッセイを3回に分けて実施します):1)ネガティブコントロール培地のみ、2)飽和濃度の組換えサイトカインを含むポジティブコントロール培地(15 ng / mLのTSLPなど)、3)コントロール間質からコントロール間質上清、および4)サイトカイン産生間質からサイトカイン-間質-上清。
5. 特定の市販のリン酸化アッセイで指定された時間(例えば、TSLPに応答したMUTZ5またはMHH-CALL4のリン酸化STAT5に対して30分)細胞をインキュベー
トします。
6. 500 x gで4°Cで5分間遠心分離し、上清をデカントします。
7. 製造元のプロトコールに従ってリン酸化フローサイトメトリー染色を実施し、フローサイトメトリーデータを収集します。
8. フローサイトメトリーデータの解析
   1. 前方光散乱(FSC、細胞サイズを示す)および側光散乱(SSC、細胞粒度を示す)に基づくインタクトセルのゲート。
   2. 各サンプル中のインタクト細胞の蛍光強度の中央値(MFI)を測定します。間質細胞上清の三重値から得られた平均 MFI を、ポジティブおよびネガティブ メディア コントロールの平均 MFI と比較します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
10 mLセロロジカルピペット	隼	357551
15 mLポリプロピレンコニカルチューブ	漁夫	05-539-12
50 mLポリプロピレンコニカルチューブ	隼	352098
1 mLピペットチップ	漁夫	2707509
200 μL ピペットチップ	デンビルサイエンティフィック	P3020-CPSの
10 μLピペットチップ	デンビルサイエンティフィック	P-1096-CP
「R20」細胞培養培地、全容量の%(195 mLを生成)			ラボレシピ
RPMI、76.84%(150 mL)	メディアテック	10-040-CV
FBS、20.49%(40 mL)	メディアテック	35-011-履歴書
2mM L-グルタミン、1.02%(2 mL)	メディアテック	35-011-履歴書
1 mM Naピルビン酸、1.02%(2 mL)
ペニシリン-ストレプトマイシン、0.51%(1 mL	メディアテック	30-002-CL
2-メルカプトエタノール、0.10% (0.1 M)、0.10% (200 μL)	MP(メガピー)	190242
生物 製剤
「CALL-4」MHH-CALL-4細胞株、ヒトB細胞前駆白病	DSMZの	ACC 337
MUTZ-5細胞株、ヒトB細胞前駆体白血病	DSMZの	ACC 490 (英語
組換えヒトTSLPタンパク質	R&Dシステム	1398-TS-010
フローサイトメリー抗体(クローン)*
抗マウスCD45 FITC(30F11)	ミルテニーバイオテック	130-102-778
CD127 PE (MB15-18C9) (別名はIL-7Rα)	ミルテニーバイオテック	〒130-098-094
CD34 APC (8G12)	BDバイオサイエンス	340667
CD45 PE-Cy7 (HI30)	eバイオサイエンス	〒25-0459
「FVD」固定性生存率色素 eFluor 780	eバイオサイエンス	〒65-0865
Ig κ 軽鎖 FITC (G20-193)	BDファーミンゲン	555791
Ig λ軽鎖FITC (JDC-12)	BDファーミンゲン	561379
IgDポリエチレン(IA6-2)	バイオレジェンド	348203
IgM PE-Cy5 (G20-127)	BDバイオサイエンス	551079
pSTAT5 PE、マウス抗STAT5(pY694)	BDホスフォフロー	612567
その他の材料および機器
FlowJoフローサイトメトリー解析ソフトウェア	FlowJo, LLC (合同会社	バージョン10
※抗体は特に記載のない限り、全て抗ヒト抗体です。

の の の ) )