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サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。
1. 固定とパラフィン包埋のための組織調製
>注:再発性尿路感染症(rUTI)の高度な管理のために、三角炎の電気フルグレーションを伴う膀胱鏡検査を受ける同意した女性から生検が行われました。rUTIは、12か月で3回のUTIと定義されています。生検収集は、インフォームド ユーザーの同意を得た後、患者が麻酔下にある間に手術室で行われました。すべてのサンプルは、実験前にコード化され、匿名化されました。
- 柔軟な膀胱鏡を使用して泌尿器鉗子を使用して膀胱トリゴーンからコールドカップ(~1 mm3)生検を取得し、1x滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で調製した1.5 mLの4% v / vパラホルムアルデヒド(PFA)を含む滅菌2 mL凍結バイアルに直ちに入れます。
注:1x PBS中の4% PFAは、事前に調製し、必要になるまで-20°Cで保存することができます。
- 室温で6時間、または4°Cで16〜24時間生検を固定します
注:固定時間は組織サンプルのサイズに基づいて計算する必要があり、過度の固定は避けてください。グルタルアルデヒドを固定剤として使用することは、自家蛍光を導入するため、お勧めしません。
- 滅菌したフードまたはバイオセーフティキャビネットで、ピペッティングで固定液を取り出し、滅菌済みの1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)1.5 mLと交換します。サンプルを4°Cで一晩保管するか、すぐに組織処理とパラフィン包埋を行います。
- 滅菌したミクロトームを使用して、5 μmの厚さで組織ブロックを切片化し、パラフィン組織切片を帯電したガラス顕微鏡スライドに接着します。16S リボソーム RNA (16S rRNA) 蛍光 in situ ハイブリダイゼーション (FISH) プロトコルには、生検ごとに少なくとも 2 枚のスライドが必要になります><。
注: 生検組織は、すべてのセクションで尿路上皮層を確実に視覚化するために、切断面に対して断面に配置する必要があります。また、切片の厚さは細菌群集の検出に最適化する必要があることにも注意する必要があります。組織に常在する細菌が極端に少ない感染症の場合(例:哺乳類細胞1,000個あたり<1個の組織常在細菌)には、より薄い切片または複数の連続切片のサンプリングが必要になることがあります。
2. ユニバーサル16S rRNAプローブによる蛍光In Situハイブリダイゼーション
>注:生検ごとに2枚のスライドが必要です。ユニバーサル16S rRNAプローブにはスライドが1枚、スクランブル配列のコントロールプローブにはスライドが1枚必要です。これは、膀胱上皮が複数のチャンネルで自己蛍光を発するため、顕微鏡検査中に真のシグナルとバックグラウンドシグナルを区別するために重要です。スクランブルプローブに加えて、マウント前に0.1%スーダンブラックBでブロッキングすると、組織に固有のバックグラウンド自家蛍光が減少する可能性があります。
- 試薬とドラフトの調製
- 空のドラフト(または適切に取り付けられたバイオセーフティキャビネット)を70%エタノールで清掃します。
- 0.9 M 塩化ナトリウム(NaCl)、20 mM トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン塩酸塩(Tris-HCl、pH 7.2)、0.1% ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)からなるハイブリダイゼーションバッファーを 10 mL 滅菌ろ過水に調製します。
注:滅菌ろ過水は、オートクレーブ処理した蒸留水を0.22 μMフィルターに通すことで調製できます。ハイブリダイゼーションバッファーは室温で保存できますが、SDSは溶液から沈殿する可能性があります。SDSが沈殿した場合は、使用前に50°Cのウォーターバスで溶液を温めてください。
- 95%エタノールと90%エタノールをそれぞれ少なくとも100 mLずつ滅菌ろ過水に入れ、洗浄済みのオートクレーブボトルで調製します。
- 蛍光標識凍結乾燥プローブを、フィルター滅菌ヌクレアーゼフリー水で調製した10 mM Tris-HCl(pH 8.0)および1 mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)バッファー(TE)に溶解し、最終濃度100 μMにします。このプロトコールで使用するために、TEバッファーで1 μMの希釈液を準備します。100 μMの濃縮ストックと1 μMのストック再構成プローブの両方を、光から保護された-20°Cで保存してください。
注:蛍光標識プローブを水に溶解しないでください。フルオロフォアをヌクレオチドプローブに結合させるN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステル結合の加水分解を防ぐためには、緩衝剤が必要です。
- 70%エタノール(EtOH)で5つのCoplinジャーを洗浄し、乾燥させ、次のようにラベルを付けます:キシレンI、キシレンII、95%EtOH、90%EtOH、二重蒸留水(ddH2O)、および適切な溶液の100mLで満たします。これにより、後の手順での混乱を避けることができます。
- 組織の脱パラフィンと水分補給
- フード内で、生検ごとに2つのスライドを垂直スライドラックに入れます。
- 縦型スライドラックをキシレンI Coplinジャー(キシレン100 mL入り)に10分間入れます。
- キシレンIからスライドラックを取り外し、ペーパータオルで底を拭き取って余分なキシレンを取り除きます。キシレンIIコプリンジャーに10分間入れます.
注意: 認定されたドラフトの外側でキシレンを使用しないでください。
- 脱パラフィン化した組織切片を、それぞれラベル付けされたCoplinジャーでそれぞれ10分間、連続したエタノール洗浄(95%および90%)で再水和します><。
注:この段階では、ハイブリダイゼーションバッファーを水浴中で50〜56°Cに温めます。
- スライドラックを90%エタノール洗浄液から取り出し、底部をペーパータオルで拭き取って余分なエタノールを取り除き、100mLのフィルター滅菌済みddH2Oが入ったddH2O Coplinジャーに10分間入れます。
- ddH2Oの洗浄を待つ間に、プローブをハイブリダイゼーションバッファーで10 nMに希釈して染色溶液を調製します。スライド1枚につき150 μLの染色液を調製します。
注:チューブをアルミホイルで包み、引き出しに保管して、染色液を光から保護します。ベンチトップで蛍光標識プローブを使用する場合は、可能であれば頭上の照明を消すことを検討してください。ハイブリダイゼーションバッファーで希釈したプローブは再利用しないでください。
- ハイブリダイゼーションと対比染色
- P1000チップボックスのリザーバーに、浸してしわくちゃにしたキムワイプと滅菌水を入れて、各プローブの加湿チャンバーを準備します。チップホルダーカートリッジを上に置きます-これがスライドが置かれる場所です.
注:ハイブリダイゼーション中に生検切片が乾燥するのを防ぐために、加湿チャンバーを使用することが重要です。市販の加湿器チャンバーは、安定した湿った雰囲気を維持するように設計されていることに注意してください。しかし、ここで詳述した手法は、大幅に低コストで湿度を十分に制御します。
- スライドをスライドラックから取り出し、新しいペーパータオル(ティッシュ面を上にして)に置きます。キムワイプを使用してスライドを乾かします。水分を逃がすために、生検セクションの近く(上ではなく)だけを軽くたたくように注意してください。疎水性ペンを使用して、生検セクションの周りに境界線を引き、スライド組織側を上にして加湿チャンバーに置きます。
注:ハイブリダイゼーションの前に組織が乾燥しないように、迅速に作業してください。
- 加湿チャンバーを50°Cに設定されたインキュベーターに入れ、染色液50-150μLを組織の上に直接ピペットで入れ、組織の周りの疎水性境界によって作られた長方形が埋められるようにします。疎水性の境界をオーバーフローさせるような溶液を追加しすぎないように注意してください。ボックスをそっと閉じます。
- 暗所で50°Cで一晩(~16時間)インキュベートします。インキュベーターに窓がある場合は、アルミホイルで覆って暗い環境を作り出します
注:信頼性の高いシグナルを得るには、FISHプローブの融解温度よりも低いハイブリダイゼーション温度が必要です。50°Cはユニバーサル16S rRNAプローブに最適な温度ですが、他のプローブには最適でない場合があります。
- 翌朝、0.9 M塩化ナトリウム(NaCl)と20 mM Tris-HCl(pH 7.2)のddH2OからなるWashバッファーを少なくとも500 mL調製し、真空ボトルトップフィルター付きの滅菌ボトルにフィルター滅菌します。水浴で50〜56°Cに温めます。
- スライドを加湿チャンバーから取り外し、キムワイプで残りのハイブリダイゼーション溶液を慎重に吸い取ります。スライドを縦型染色ラックに置きます。
- 染色ラックを、100 mLの予熱済み洗浄バッファーが入った不透明なCoplinジャーに10分間入れます。Coplinジャーが不透明でない場合(ガラスなど)、インキュベーションステップ中に暗闇に置きます—おそらく箱の下または引き出しの中。
- 新しいCoplinジャーに新鮮な洗浄バッファーを入れて、洗浄ステップを2回繰り返します。
- 洗浄ステップでは、Hoechst 33342 1:1,000の100 μg/mLストック溶液を洗浄バッファーで希釈して、対比染色を調製します。同じチューブに、Alexa-555小麦胚芽凝集素(WGA)を最終濃度5μg/mLに、Alexa-555ファロイジンを最終濃度33 nMに添加します。使用する準備ができるまで暗闇に保管してください。
注:Hoechst、Alexa-555 WGA、およびAlexa-555 Phalloidinは、それぞれデオキシリボ核酸(DNA)、ムチン/ウロプラキン、およびアクチンをラベル付けし、製造元の指示に従って暗闇で長期間保管できます。プローブや対比染色に使用される蛍光標識は、使用する顕微鏡で利用可能なフィルターセットに合わせてカスタマイズできます。
- 最後の洗浄からスライドを取り外し、キムワイプで余分な洗浄バッファーをやさしく吸い取ります。スライドをティッシュ面を上にしてペーパータオルの上に置き、ティッシュペーパーの上に50〜150μLの対向染色剤を直接加えて、疎水性の境界が埋められますが、あふれないようにします。最大4枚のスライドをクライオボックストップで覆い、室温で10分間インキュベー
トします。
- 側面を染色ラックに戻し、新鮮なウォッシュバッファーを入れたCoplinジャーでさらに2回、それぞれ10分間洗浄します。
- 最後の洗浄後、スライドを完全に乾かし、クライオボックストップの下のペーパータオルの上にティッシュ面を上にして置きます。1滴の封入剤をティッシュの上に直接絞ります。適切なサイズのカバースリップ(生検のサイズによって異なります)を上にそっと置きます。気泡はイメージングの妨げとなり、カバースリップしたスライドが暗闇で一晩硬化する可能性があるため、気泡をそっと押し出します。
- 翌日、カバーガラスの端を透明なマニキュアの薄いコートでスライドに密封します。暗所で10分間乾燥させた後、共焦点顕微鏡検査のために4°Cの暗所で保管します。
>3. 共焦点顕微鏡による16S rRNA FISHの可視化
>注:このプロトコルでは、63倍および100倍の対物レンズを備えたレーザー走査型共焦点顕微鏡で最良の結果が得られます。Hoechst、Alexa-488、およびAlexa-555の蛍光を可視化するための適切なフィルターセットが必要です。ただし、共焦点顕微鏡が利用できない場合は、標準的な蛍光顕微鏡法を使用できます。このプロトコルは、レーザー走査型共焦点顕微鏡用です。
- 製造元の指示に従って、共焦点顕微鏡と顕微鏡に関連付けられているコンピューターソフトウェアの電源を入れます。
- スライドをロードし、青 (Hoechst) チャネルの 10x 対物レンズで視覚化します。原子核が見えるまで慎重に焦点を合わせます。
- ピントを合わせたら、対物レンズを高倍率(63倍または100倍)に変更します。カバーガラスの上に油を追加します。新しい対物レンズで焦点を合わせ直し、焦点を合わせているときに対物レンズがオイルに接触することを確認します.
注意: 高倍率(63倍または100倍)でのファインフォーカスのみを使用してください。オイルは、オイルの目的にのみ使用してください。
- 緑色(強化緑色蛍光タンパク質、eGFP/Alexa-488)チャンネルの接眼レンズを通じて各スライドを迅速に評価し、どのスライドがFISH陽性で、どのスライドがFISH陰性であるかを判断します
注:この最初の評価/採点は、実験バイアスを減らすために、別の個人によって盲検化されて行われるのが最善です。
- 染色された生検を画像化するには、FISHポジティブスライドから始めて、コンピューター視覚化モードに切り替えます。405(Hoechst)、488(Alexa-488)、555(Alexa-555)の各チャンネルを選択します。最も長い波長チャネル(この場合は555)を使用してピンホールを設定します。488チャンネルで標識された細菌を可視化するための正しい焦点面を見つけます。焦点面を変更せずに、信号が飽和せず、背景が過度に補正されないように、各チャンネルのゲイン、レーザー出力、オフセットを設定します。3 つのチャネルすべてで画像を取得します。
注:488チャンネルに同じ設定を使用して、実験のすべてのスライドを画像化します。レーザー出力は、細菌の視覚化に最適な焦点面がフィールド間で異なる場合、405および555チャネルで調整が必要になる場合があります。