UV照射によるアポトーシスT細胞の生成のためのIn Vitro技術

要約

出典:Hodge, M. X., et al. オゾン曝露後の肺胞マクロファージエフェロサイトーシスの生体内評価。 J. Vis. Exp. (2019).

このビデオは、ヒトTリンパ球白血病細胞株であるJurkat細胞にアポトーシスを誘導する方法を示しています。細胞は紫外線C(UVC)光にさらされ、広範なDNA損傷を引き起こし、アポトーシス細胞死を引き起こします。

プロトコル

1. Jurkat T細胞株の調製(2日目)

>注:すべての手順は、クラスIIの生物学的安全キャビネットで実施する必要があります。

1. Jurkat T細胞を24 mLの基礎細胞培養培地+ 10% FBS + 5%ペニシリン/ストレプトマイシン、37°C+5%CO₂で培養します(材料表)。Jurkat T細胞は、3日ごとに予熱培養培地に1:6-1:8を継代することで維持できる浮遊細胞株です。振らないでください。
2. アポトーシス細胞を調製するには、各フラスコでアポトーシス細胞を90%のコンフルエントまで増殖させます(継代後達成には3〜4日かかります)。この研究では、5つのT75フラスコからの細胞を使用して、このプロトコルで使用される十分な数の細胞を取得します。
   手記：コンフルエントフラスコには、約2,000万〜2,400万個の細胞が含まれています。
3. 各フラスコ(約24 mL)から細胞(フラスコ全体)をピペットで取り出し、血清学的ピペットを使用して細胞を滅菌済みの50 mLコニカルチューブに移します。複数のフラスコには複数の円錐形のチューブを使用します。
4. 50 mLのコニカルチューブから11 μLの細胞分を取り出し、11 μLのトリパンブルーステインと混合し、11 μLを血球計算盤スライドにピペットで移します。
5. スライドを自動セルカウンターに挿入し、生細胞の数を記録して、各フラスコに24 mLの培地が含まれているため、生細胞の数に24を掛けて各フラスコの総細胞数を計算します。
6. 細胞懸濁液を271 x gで室温(RT)で5分間遠心分離し、細胞をペレット化します。
7. 吸引により上清を廃棄し、細胞ペレットを培地に再懸濁して、mLあたり3.0 x 10⁶細胞を得ます。
8. 100 mm x 20 mmの組織培養皿に5 mLの細胞を分注します(約9つの皿を使用します。各皿の細胞の総量は~15 x 10⁶である必要があります)。
9. 1つのディッシュをコントロール/未露出に使用すると、残りのディッシュはUVにさらされます。
10. UV架橋剤を正しいエネルギーレベルに設定し、エネルギーボタンを押して、テンキーを使用して「600」を入力すると、マシンは600μJ / cm² x 100.
    と読み取ります 手記： UV架橋剤のエネルギー単位はμJ/cm² x 100です。したがって、60ミリジュール/cm²を達成するには、UV架橋剤と一致するように単位を変換します。
11. UV架橋剤を用いて、コントロールを除くすべての皿に細胞を60ミリジュール(mJ)/^cm2で照射します。UV光はプラスチックカバーを透過しないため、UV曝露中は組織培養皿の上部カバーを取り外してください。
12. 非曝露コントロールを含む細胞培養インキュベーター内のすべてのディッシュを、37°C、5%_CO2、4時間インキュベー
トします。
13. インキュベーションの4時間後に、アネキシンVとヨウ化プロピジウム(PI)(それぞれアポトーシスと壊死のマーカー)を含むアポトーシスアッセイ検出キットを使用して、フローサイトメトリーによるアポトーシスを確認します。
    手記：4時間のインキュベーション後、UV架橋剤中のJurkat T細胞を600μJ/cm²のエネルギーレベルで照射すると、アポトーシス(初期および後期の両方)細胞の≥75%が後期アポトーシス表現型よりも早期アポトーシス表現型が高くなります。これにより、後期アポトーシス細胞とは異なり、肺胞マクロファージが肺胞マクロファージを認識して包み込むことが容易になり、この研究では、肺胞マクロファージのエフェロサイトーシスのより高いefferocytic指数とより正確なイメージングにつながります。
    1. 複数のディッシュ(「UVなし」と「UV露光済み」の両方)からJurkat T細胞333 μL(1 x 10⁶細胞)をプールして、コンペンセーション分析チューブに使用します。
    2. 未染色のアネキシンV単染色、PI単染色、UVコントロールなし、および600 μJ/cm² UV曝露標識フローサイトメトリーチューブ中のJurkat T細胞333 μLを分注します。
    3. チューブを188 x gでRTで5分間遠心分離し、上清をデカントします。
    4. 細胞を洗浄するには、500 μLの1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で再懸濁します。
    5. RTで細胞を188 x gで5分間遠心分離し、ペレット化し、遠心分離後に上清を廃棄します。
    6. 細胞を遠心分離している間に、10x結合バッファーを蒸留水で希釈することにより、フローチューブあたり400μLの1x結合バッファーを調製します。
    7. アネキシンVおよびPIインキュベーション試薬(サンプル/チューブあたり100 μL)をメーカーの指示に従って調製します。
    8. 遠心分離後に上清をデカンタントし、すべてのチューブを400 μLの1x結合バッファーに穏やかに再懸濁し、次に100 μLのアネキシンVインキュベーション試薬を各サンプルチューブに加えます。最後に、100 μLのannexin VシングルステインおよびPIシングルステインをそれぞれのチューブに加えますが、未染色のチューブには1x結合バッファー以外は何も加えないでください。
    9. チューブを暗闇でRTで15分間インキュベートします。
    10. すべての細胞を188 x gで5分間、RTで遠心分離し、上清をデカントします。
    11. 細胞を400 μLの1x結合バッファーに再懸濁し、フローサイトメトリーでサンプルのアポトーシスを分析します。チューブごとに少なくとも10,000のイベントを収集して、染色を正確に表現できるようにします。
14. ディッシュから照射したすべての細胞を50 mLのコニカルチューブに結合し、271 x gでRTで5分間遠心分離することにより、細胞をペレット
化します。
15. 吸引によりチューブから上清を廃棄し、細胞を24 mLの滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に再懸濁し、ペレット細胞を271 x gで室温で5分間遠心分離して再懸濁します。
16. 吸引によってチューブから上清を捨て、IACUCによって承認されたマウスの投与に使用されたPBSの量で細胞を再懸濁します。使用される用量は、マウスあたり5〜10 x 10⁶細胞/ 50μLです。したがって、10匹のマウスについては、500μLで再懸濁します(各用量の細胞数は、照射のために培養する細胞の数によって異なります)
    手記：ピペットチップの側面に付着して細胞が失われる可能性のある液体を考慮して、少なくとも2回追加投与してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アネキシンV-FITCキット	トレビゲン	4830-250-K	TACS Annexin V-FITC Kitは、フローサイトメトリーを使用して、個々の細胞のアポトーシスを迅速、特異的、かつ定量的に同定することができます。
BCL2 Jurkat T細胞	ATCCの	ATCC CRL-2899	BCL2 Jurkat細胞株は、ヒトBCL-2 ORFインサートとネオマイシン耐性遺伝子を含むpSFFV-neo哺乳動物発現ベクターをヒトJurkat T細胞にトランスフェクションすることによって得られました。エフェロサイトーシスを測定するモデルに使用されています。
Countess II 自動セルカウンター	サーモフィッシャー	AMQAX1000	これは、懸濁液中の細胞を迅速に評価するための最先端の光学系、フルオートフォーカス、および画像解析ソフトウェアを備えたベンチトップアッセイプラットフォームです。非常に使いやすいです。
Cytospin 4 細胞遠心分離機	サーモフィッシャー	A78300003	あらゆる液体マトリックス、特に気管支肺胞洗浄液などの低細胞液から経済的な薄層製剤を提供します。
ウシ胎児血清、認定済み、熱不活化	サーモフィッシャー	16140071	培養細胞が成長するための栄養素を提供します。細胞培養の標準です。
ペニシリン-ストレプトマイシン	シグマ/アルドリッチ	P0781-100ミリリットル	ペニシリン-ストレプトマイシンは、哺乳動物細胞の培養に最も一般的に使用される抗生物質溶液です。さらに、細胞培養中に無菌状態を維持するために使用されます。
RPMI 1640 ミディアム、GlutaMAX サプリメント	サーモフィッシャー	61870036	RPMI 1640培地(Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium)は、もともとヒト白血病細胞を懸濁液および単分子膜として培養するために開発されました。それ以来、RPMI 1640培地は、HeLa、Jurkat、MCF-7、PC12、PBMC、アストロサイト、がん腫など、さまざまな哺乳動物細胞に適していることがわかっています。Jurkat T細胞を迅速かつ効率的に増殖させます。
Stratagene UV Stratalinker 1800 UVクロスリンカー	ケンブリッジ・サイエンティフィック	16659	Stratalinker UV架橋剤は、アポトーシス、DNAまたはRNAをナイロン、ニトロセルロース、またはナイロン強化ニトロセルロース膜に誘導するように設計されています。