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サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。
1. サンプル調製
- 9 mLのヘパリンチューブに末梢血を採取し、実験プロトコルに必要になるまでローター内でサンプルを室温(RT)に維持します。
- ネガティブコントロール(2チューブ)、ポジティブコントロール(2チューブ)、および異なる濃度のアレルゲン/薬物(試験したアレルゲン/薬物濃度ごとに1チューブ)の5mLサイトメーターチューブを標識します。チューブが滑らずに完全にフィットするラックにチューブを置きます。
- 2%(v/v)HEPES、78 mg/L NaCl、3.7 mg/L KCl、7.8 mg/L CaCl2、3.3 mg/L MgCl2、1 g/L HSAを含む二重蒸留水で刺激緩衝液を調製します。pH を 7.4 に調整し、IL-3 を 2 ng/mL で添加します。通常、100mLを調製し、2.5mLのアリコートに分けて-20°Cで凍結します。
- PBS-Tween-20 0.05%(v / v)(PBS-T)でポジティブコントロールを準備します:ポジティブコントロール1、N-ホルミルメチオニルロイシルフェニルアラニン(fMLP)(4μM)、好塩基球の品質を確認します。ポジティブコントロール2、IgE媒介ポジティブコントロールとしての抗IgE(0.05 mg / mL)。
- PBS-Tでアレルゲン/薬物を所望の最終濃度の2倍で調製します.
手記：使用する最適なアレルゲン/薬物濃度は、広範囲の濃度、用量反応曲線、および同じプロトコルステップに従った細胞毒性試験によって事前に決定する必要があります。
>2. 染色ミックス調製
- 蛍光色素で標識したモノクローナル抗体を、メーカーが推奨する抗体濃度に従って、または以前の抗体滴定に従って刺激バッファーに添加します。このプロトコールでは、各抗体(CCR3-APCおよびCD203c-PE)を1 μL加えます。好塩基球の同定のために;好塩基球活性化のためのCD63-FITC)刺激緩衝液20μLあたり
手記：染色ミックス調製物を光から保護します。
- 各チューブに23 μLの染色ミックスを加えます。
3. 血液刺激
- チューブ 1 および 2 に PBS-T 100 μL を、チューブ 3 に fMLP 100 μL を、チューブ 4 に 100 μL の抗 IgE を、次のチューブに異なるアレルゲン/薬物濃度 100 μL を添加します。温めた試薬を中温混合したサーモスタット槽で37°Cで10分間インキュベートします。
- 溶血を避けるために、各チューブに100μLの血液をそっと加えます。チューブを穏やかにボルテックスし、中程度に攪拌したサーモスタット槽で37°Cで25分間インキュベートします。
- 脱顆粒を停止し、チューブを4°Cに少なくとも5分間保持します
手記：プロトコールは、必要に応じて4°Cで30〜45分間一時停止できます。
4. 赤血球の溶解
- 2 mLの1x溶解バッファーを各チューブに加えて、赤血球を溶解します。各チューブをボルテックスし、RT.
で5分間インキュベートします
手記：このステップでは、バッファーに含まれる固定剤(ホルムアルデヒド)により細胞が固定されます。
- 300 x g、4°Cで5分間遠心分離し、上清をデカントし、ラックをひっくり返してシンクにします。細胞はチューブの底に残ります。
- 各チューブに3 mLのPBS-Tを加えて細胞を洗浄します。各チューブを渦巻きにします。
- 300 x g、4°C、5分間遠心分離し、上清をデカントし、ラックをひっくり返してシンクにします
手記：サンプルは4°Cに保ち、フローサイトメーターが取得されるまで光から保護します。
>5. フローサイトメトリーの取得
- フローサイトメーター(BD FACSCalibur Flow Cytometerなど)でサンプルを採取します。フローサイトメーターをコンピューターソフトウェアに接続し、サイトメーターの準備が整うのを待ちます。テンプレートと装置の設定をロードします(表1)。
- サンプル取得を開始します。
- 活性化好塩基球の選択には、以下のサイトメーター戦略を使用してください。
- 側方散乱光(SSC)-前方散乱(FSC)プロットからリンパ球をゲートします。
- リンパ球集団からの好塩基球をCCR3 + CD203c +細胞としてゲートします。チューブあたり少なくとも500の好塩基球を取得します。
- CCR3 - CD63 プロットを表示して、CD63 を活性化マーカーとして使用して活性化を解析します。ネガティブコントロールチューブを使用して、CD63の負のしきい値を約2.5%に設定します。
- すべてのサンプルを取得します。
>表1:フローサイトメーターの要件
| 光源(レーザー) | 488 nm Coherent SapphireTM 空冷アルゴン イオン レーザ、20 mW、633 nm JDS UniphaseTM HeNe 空冷レーザ、17 mW |
| 光興奮性波長 | 青色レーザー:488 nm;赤色レーザー:633nm |
| 興奮性波長での光源パワー | 青色レーザー:20 mW;赤色レーザー:17 mW |
| 光学フィルター | SSC:488/10;FITC:530/30、PE:585/42、APC:660/20 |
| 光学検出器 | FSC、SSC、FL1-H FITC、FL2-H PE、FL4-H APC |
| 光学検出器タイ | 空冷式アルゴンイオンレーザー |
| 光パス | BD八角形(488 nmレーザーライン);BD Trigons (633 nm レーザーライン) |