$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. マイクロインジェクション針の準備
- マイクロピペットプーラー装置を使用して、空気圧200、熱502、プル90、速度80、時間70、プル5開始時の空気時間、プル5終了時の空気時間。
- 細いピンセットを使って、引っ張った針の先端を折って、先端の開口部の直径が約10μm
になるようにします。
2. 幼虫注射皿の準備
- レーン幅約4〜5 mmのゲルコームを滅菌水ですすぎ、乾燥させます。
- E3培地で1.5〜2%の高溶融アガロース溶液を調製し、溶液が透明になるまで電子レンジで加熱します。冷めたら、アガロースの一部をペトリ皿(100 x 15 mm)に注ぎ、渦巻き、皿の底を完全に覆うのに十分なアガロースを追加します。
- アガロース層が固まったら、すすぎ乾燥させたゲルコームを上に置いて、コーマしていない端がペトリ皿の上部にちょうど載り、コーマの端がアガロースに触れるようにします。コームができるだけ水平になるようにし、下部のアガロース層に対して30°の角度を作成します。
- 櫛と底部のアガロース層との間の界面にさらに少量のアガロースを注ぎ、新鮮なアガロース層が櫛のウェルを覆うようにします。コームを取り外す前に、完全に冷ましてください。ピペットチップを使用して、ウェルから張り出したアガロースの破片を取り除きます。
- E3培地を射出成形金型の上に流し込み、4°Cで保存します。
- 毎回使用する前に、注入の少なくとも1時間前に、28.5°Cで新しい中温注入ランプと交換してください。
- 注入の直前に、注入ランプのE3を、200 μg / mlの3-アミノ安息香酸エチル(トリカイン)を含むE3培地と交換します。.
>3. Streptococcus iniae (S. iniae) Inoculumの調製
- 0.2%酵母抽出物と2%プロテオースペプトン(THY+P)を添加したトッドヒューイットブロス培地を調製し、オートクレーブ処理します:30 g / Lトッドヒューイット、2 g / L酵母抽出物、20 g / Lプロテオースペプトン。寒天プレートの場合は、14 g / Lの寒天を追加します。
- 感染前夜に、100 μLの凍結細菌ストックを10 mLのTHY+Pブロスにピペットで移し、密封した15 mLチューブに入れて細菌培養物を調製します。撹拌せずに37°Cで一晩インキュベートします。成長の14-16時間後、冷凍庫のストックを作るか、または注射で使用するための準備をするために一晩培養します。
- 1.7 mLの遠心チューブに1 mLの80%グリセロール500 μlを入れた一晩培養液をフリーザーストックとして調製します。凍結融解サイクルを避けるため、この混合物から100 μlの1回使用アリコートを調製し、-80°Cで保存してください。
- 感染症に使用されるS. iniaeの場合、9.9 mlのTHY+Pブロスに0.1 mlのオーバーナイトカルチャーを添加して、オーバーナイトカルチャーを1:100に希釈して総量10 mlのカルチャーにします。攪拌せずに37°Cで約4〜5時間成長させます。Nanodrop分光光度計を使用して600 nmの光学密度(OD)を監視し、OD600 nmが0.250-0.500に達したときに中対数位相で細菌を収穫します。OD600 nmが0.250の場合、約108コロニー形成単位(CFU)/mlに相当します。
- 1.7 mLの遠心チューブに1 mLの細菌培養液を1,500 x gで5分間ペレット化し、1 mLの新鮮なリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に再懸濁して繰り返します。PBS中の細菌のOD600 nmを測定し、ペレット化し、PBSに再懸濁して目的の濃度を達成します。
- マイクロインジェクションの可視化を支援するために、注入前に細菌懸濁液にフェノールレッドを添加して、最終濃度を0.1%にします。
- 加熱死滅細菌の注入実験では、PBS中の細菌を95°Cで30分間加熱し、THY+P寒天プレートに注入量(約1nl)をめっきし、37°Cで一晩インキュベートすることにより、熱死化プロセスにより生菌数が検出不能レベルまで減少したことを確認します。
4. CellTracker Red Fluorescent DyeによるS. iniaeの標識
- 生きた細菌細胞を標識するには、CellTracker蛍光色素または同等物のストック溶液を調製します。使用する染料は20 x 50 μgの粉末で提供され、ジメチルスルホキシド(DMSO)に再懸濁する必要があるため、7.3 μl DMSOをチューブに加えて10 mMのストック濃度を得ます。
- 細菌でさまざまな色素濃度(0.5〜25 μMなど)を試験して、細胞を染色する最適な濃度の最低を決定します。細胞を急速に分裂させたり、実験を長時間行ったりすると、より高濃度の色素が必要になる場合があります。
- 上記のように遠心分離により、1.7mlチューブ内の細菌培養物1.0mlをペレット化します(セクション3)。ペレットを1 mLの新鮮なPBSに再懸濁し、適切な量の色素を細菌培養物に加えます。
- 撹拌せずに37°Cで30分間インキュベートし、細菌をスピンダウンし、予熱したTHY+Pブロス1 mLに再懸濁し、攪拌せずに37°Cでさらに30分間インキュベー
トします。
- バクテリアをスピンダウンし、PBSで2回洗浄してから、OD600 nmを測定し、上記のようにマイクロインジェクションのためにバクテリアを希釈します(セクション3)。通常、白血球の動員と食作用の研究のために、1 nl の注入量に約 100 CFU を注入します。
>5. ゼブラフィッシュの幼虫の感染症対策
- 前夜に繁殖ペアを設定し、Rosenらが説明したように胚を収集します。感染する準備ができるまで、E3培地で28.5°Cで胚をインキュベートします。
- 画像化するゼブラフィッシュの場合、受精後24時間(hpf)にN-フェニルチオ尿素(PTU)をE3培地に添加して最終濃度0.2 nMにすることにより、色素の発生(メラニン化)を防ぎます。
- 受精後2日齢の胚(dpf)が関与する感染症の場合、細いピンセットで手動で胚をデコリオネートします。あるいは、E3を除去し、プロナーゼ(2 mg / ml)で約5分間、または穏やかなピペッティングで胚が絨毛膜から離れるまで、胚をデコレーションします。ほとんどの幼虫は3dpfまでに自然に孵化しているはずです。
- ゼブラフィッシュに感染する数分前に、デコレーションした幼生を200 μg/mlのトリカインを含むE3培地に入れて麻酔をかけます。
>6. S. iniaeの3日齢幼虫へのOtic Vesicle Injection(S. iniaeの3日齢幼虫への注射)
- マイクロインジェクターの電源を入れ、時間範囲を「ミリ秒」に設定します。二酸化炭素タンクのバルブを開いて、ガスをラインに入れます。マイクロインジェクターの圧力は、約20ポンド/平方インチ(PSI)を読み取る必要があります。マイクロインジェクターユニットの圧力を調整するには、黒いローレットノブを時計回りに回して圧力を上げるか、反時計回りに回して圧力を下げる必要があります。
- 調製したS. iniae培養物をフェノールレッドとPBSでボルテックスし、マイクロローダーチップを使用して、培養物の2〜3μlを引っ張ったキャピラリー注入針にロードします。
- ロードされた針を磁気スタンドに接続されたマイクロマニピュレーターに取り付け、針が顕微鏡の底面に対して約45〜65°の角度になるように実体顕微鏡の下に配置します。
- マイクロインジェクターのフットペダルを押して、接種物を針の先端に一滴分注します。顕微鏡の接眼レンズのスケールバーを使用して、液滴の直径を測定します。
- あるいは、スケールバー付きのガラス顕微鏡スライド上の鉱物油の滴に体積を注入することにより、液滴の直径を推定します。液滴の直径は約0.10 mmで、これは約1 nlの体積です。
- 液滴のサイズを調整するには、マイクロインジェクターの持続時間設定を調整するか、細いピンセットで針先をさらに切り取ります。注入時間は、組織の損傷を過度に引き起こさないように、20〜35ミリ秒である必要があることに注意してください。
- プラスチック製のトランスファーピペットを使用して、麻酔をかけた12匹の幼虫を射出成形金型の各ウェルに移します。
- ガラス棒、ヘアループ、またはプラスチック製の先端を使用して、頭が顕微鏡の背面を向き、卵黄嚢がウェルの左側にくれるように、幼虫をそっと配置します。幼虫の左耳を天井に向けてください。
- 実体顕微鏡の接眼レンズを通して、マイクロマニピュレーターのノブを使用して、負荷された針を耳小胞に合わせ、両方が同じ視野に入るようにします。耳小胞の外側の上皮層を針先で突き刺し、針先が小胞のすぐ内側にくるようにします。
- フットペダルを押して、S.iniaeの希望用量の1nlを注入します。キャビティが破裂しないように、必ず十分に低い圧力を使用してください。注射が成功した場合、耳小胞は満たされますが、周囲の組織には充填されません(図1Ai)。誤って注入した魚をすぐに注入プレートから取り出します。
- 針を幼虫から慎重に引っ込め、次の幼虫が見えるように手で注射プレートを動かします。5倍の倍率でこれを行います.
手記：針が後退すると、耳小胞の外側に一部の細菌が沈着する可能性があり、生存率と白血球の動員結果を歪める可能性があります。これを避けるために、蛍光染料で標識された細菌を注入し、注入された幼虫を蛍光顕微鏡で視覚的にスキャンして、これが発生した幼虫を取り除くことをお勧めします。正しく注入された幼虫を(図1 Bi)に示します。
- 実験の過程で注入量/接種物が同じままであることを確認するために、48番目の胚ごとに100μlの滅菌PBSを含む1.7 mLの遠心チューブに細菌懸濁液を一滴注入します。100 μlをTHY+P寒天プレートに37°Cで一晩プレートし、注入量中のCFUを測定します。
- 注入ランプ上の12匹の幼虫のグループ全体が注入されたら、プラスチック製の移送ピペットを慎重に使用して幼虫をウェルから取り出し、新しいシャーレ(35 x 10 mm2)に入れます。トリカイン溶液を取り出し、約2 mlの新鮮なE3培地と交換して、幼虫が回復できるようにします。
- ピペットで幼虫を96ウェルプレートの1つのウェルに注入し、28.5°Cでインキュベートしました。これらのプレートで幼虫が生存するまで経時的にモニタリングするか、後でイメージングまたはCFUカウントのために幼虫を除去します。
>7. イメージングのための幼虫の固定
- セクション7で説明されているように、幼虫をPBS溶液中の氷冷した4%パラホルムアルデヒドに固定します。
- 室温でPBSで各5分間3回洗浄してからイメージングします。
8. ライブイメージングのための幼虫の準備
- E3に1.5%低融点のアガロース溶液をマイクロ波で加熱して、溶液が透明になるまで調製します。
- アガロース溶液を55°Cのウォーターバスに入れて冷ましますが、固まらないようにします。
- アガロースにトリカインを添加し、最終濃度を0.016%にします。
- プラスチック製のトランスファーピペットを使用して、麻酔をかけた幼虫を実体顕微鏡のステージ上のガラス底皿に4〜5匹入れます。
- トリカインとアガロースの溶液を55°Cのウォーターバスから取り出し、室温で1〜2分間冷まします。アガロースが冷却されている間に、麻酔をかけた幼虫からできるだけ多くの液体を取り除きます。
- 表面の約半分が覆われるまで、冷やしたアガロースを皿に注ぎます。皿を渦巻いてアガロースを広げます。アガロースが熱すぎると、幼虫が死んでしまうことに注意してください。また、皿にアガロースを入れすぎると、アガロースを通してピントを合わせる際に顕微鏡の対物レンズが皿の底に当たることがあります。
- トランスファーピペットを使用して、皿の側面に浮かんだ幼虫を拾い上げ、ピペットで中央に戻します。
- 実体顕微鏡の下で、ヘアループ、長いピペットチップ、またはガラス棒を使用して、必要に応じて幼虫を静かに配置します。耳小胞のイメージングには、左の耳小胞が皿の底に対して平らになるように幼虫を配置します。
- アガロースを約10分間冷ましてから、皿を動かします。アガロースが固まっていない場合、幼虫は位置を移動する可能性があります。トリカインとE3溶液をアガロース層の上部にそっとピペッティングして、湿らせます。
>9. 感染の共焦点イメージング
- 幼虫の入ったガラス底皿を、FV-1000レーザー走査型共焦点システムを搭載した倒立顕微鏡のステージに置きます。
- ピンホールを200〜300μmに設定し、0.75 / 20X対物レンズの数値絞りを使用して、zスタックを3〜6μmスライスに設定します。
- 連続ラインスキャンを使用して、各チャンネルのレーザー出力と検出器ゲインを調整します。
- 各蛍光チャネル(488nmや543nmなど)のシーケンシャルラインスキャンと微分干渉コントラスト(DIC)を使用して、左耳小胞のタイムラプス動画を3分ごとに2〜6時間撮影し、好中球とマクロファージによる初期動員と食作用を観察します。長時間のコースの場合は、アガロースの蒸発と乾燥を防ぐために、ペトリ皿に蓋をします。
- 固定幼虫(図1B)または生きた幼虫(図2)の静止画を20倍または40倍の倍率で取得します。
>10. 耳小胞におけるDendra2標識白血球の光変換
>注:Dendra2は、405nmレーザー(50-70%のレーザー出力で十分)を関心領域(ROI)に1分間集中させることにより、緑色から赤色の蛍光に光変換することができます。以下は、FV-1000レーザースキャン共焦点システムに使用されるステップバイステップのプロトコルです。
- 488 nmおよび543 nmレーザーによるzスタックスキャンを使用して、サンプルを視覚化します。連続ラインスキャンを使用して、レーザー出力と検出器のゲインを調整します。誤って光変換された赤色蛍光がないことを確認してください。
- 「Image Acquisition Control」ウィンドウの「Stimulus Setting」で「Use Scanner」ツールを選択し、「Main」を選択します。405 nmレーザーを選択し、70%の出力に設定します。circleオプションを使用して、耳小胞のROIを定義します。
- 「Stimulus Start Setting」で「Activation in series」を選択し、プリアクティベーションを1フレーム、アクティベーション時間を60,000ミリ秒に設定します。「Time Scan」見出しの下の「Acquisition Setting」ウィンドウで、00:01:00の2つの間隔を選択します(1つは写真変換前用、もう1つは写真変換後用).
手記：タイムラプスシリーズのスキャンが完了した後、Dendra2は赤色蛍光状態に光変換されているはずです。
- 488 nmおよび543 nmレーザーを使用してZスタックでサンプルをスキャンし、光変換された赤色蛍光と残りの緑色蛍光を視覚化します(図3)。
