リンパ球のサブタイプを特徴付けるための三次元定量的位相イメージング

Abstract

出典: Yoon, J. et al. Label-Free Identification of Lymphocyte Subtypes Using Three-Dimensional Quantitative Phase Imaging and Machine Learning. J. Vis. Exp.(2018年)

このビデオは、3D定量的位相イメージングによるリンパ球の形態と生化学のラベルフリー同定を示しています。この技術により、リンパ球の徹底的な分析が可能になり、ラベリング手順を必要とせずにリンパ球の内部構造と特性を明らかにすることができます。

Protocol

>1. フローサイトメトリーとリンパ球サブタイプの選別

注:細胞タイプに応じてリンパ球を選別することは、教師あり学習で細胞タイプ分類器を訓練およびテストするためのグラウンドトゥルース(つまり、正しい)細胞タイプラベルを確立するために不可欠です。ゴールドスタンダードの方法であるフローサイトメトリーは、リンパ球の同定と分離に使用されます。

1. 100 μLの新鮮なRPMI-1640培地[10% FBS、0.1 μgのCD3e(17A2)、CD8a(53-6.7)、CD19(1D3)、CD45R(B220、RA3-6B2)、およびNK1.1(PK136)]と、標的B、CD4⁺ T、およびCD8⁺ Tリンパ球に対する0.25 μgのCD4(GK1.5)抗体に表面マーカー染色抗体を混合します。
2. 抗体混合物100 μLを細胞懸濁液に加えます。
3. 氷上で25分間インキュベートします。
4. 5 mLのPBSを添加し、400 x gで5分間、4°Cで2回遠心分離して細胞を洗浄します。
5. 細胞ペレットを5 mLの新鮮なRPMI-1640培地に10% FBSと2.5 μgのDAPI(4',6-ジアミジノ-2-フェニルリンドール)を加えて再懸濁します。
6. 上記のマーカーの蛍光レベル....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
フローサイトメトリー	BDバイオサイエンス	アリアIIまたはIII
イメージングチャンバー	株式会社トモキューブ	トモディッシュ
ホロトモグラフィー	株式会社トモキューブ	HT-1Hの
ホロトモグラフィーイメージングソフトウェア	株式会社トモキューブ	トモスタジオ
画像処理ソフトウェア	MathWorksの	Matlab R2017bの
ファルコンコニカル遠心チューブ	サーモフィッシャーサイエンティフィック	14-959-53A	15ミリリットル
リン酸緩衝生理食塩水	シグマ・アルドリッチ	806544から500ミリリットル
アンモニウム-塩化物-カリウム溶解バッファー	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A1049201
RPMI-1640 ミディアム	シグマ・アルドリッチ	R8758
ウシ胎児血清	サーモフィッシャーサイエンティフィック	10438018