リンパ球のサブタイプを特徴付けるための三次元定量的位相イメージング

要約

出典: Yoon, J. et al. Label-Free Identification of Lymphocyte Subtypes Using Three-Dimensional Quantitative Phase Imaging and Machine Learning. J. Vis. Exp.(2018年)

このビデオは、3D定量的位相イメージングによるリンパ球の形態と生化学のラベルフリー同定を示しています。この技術により、リンパ球の徹底的な分析が可能になり、ラベリング手順を必要とせずにリンパ球の内部構造と特性を明らかにすることができます。

プロトコル

>1. フローサイトメトリーとリンパ球サブタイプの選別

注:細胞タイプに応じてリンパ球を選別することは、教師あり学習で細胞タイプ分類器を訓練およびテストするためのグラウンドトゥルース(つまり、正しい)細胞タイプラベルを確立するために不可欠です。ゴールドスタンダードの方法であるフローサイトメトリーは、リンパ球の同定と分離に使用されます。

1. 100 μLの新鮮なRPMI-1640培地[10% FBS、0.1 μgのCD3e(17A2)、CD8a(53-6.7)、CD19(1D3)、CD45R(B220、RA3-6B2)、およびNK1.1(PK136)]と、標的B、CD4⁺ T、およびCD8⁺ Tリンパ球に対する0.25 μgのCD4(GK1.5)抗体に表面マーカー染色抗体を混合します。
2. 抗体混合物100 μLを細胞懸濁液に加えます。
3. 氷上で25分間インキュベートします。
4. 5 mLのPBSを添加し、400 x gで5分間、4°Cで2回遠心分離して細胞を洗浄します。
5. 細胞ペレットを5 mLの新鮮なRPMI-1640培地に10% FBSと2.5 μgのDAPI(4',6-ジアミジノ-2-フェニルリンドール)を加えて再懸濁します。
6. 上記のマーカーの蛍光レベルを使用して、フローサイトメトリーで各リンパ球タイプを別々に収集します。DAPI信号を使用してデッドセルを同時に除外します。

>2. 3D 定量位相イメージング

1. 細胞の損傷や生化学的変化を避けるために、5時間以内(マウスからのリンパ球の分離以降)に完了する必要があるイメージング手順全体を通して、選別されたリンパ球を氷上に置いてください。
2. 選別された細胞タイプ(B、CD4⁺ T、およびCD8⁺ Tリンパ球)を選択し、最適なイメージング条件(すなわち、1つの視野につき1つの細胞)を得るために、サンプルをRPMI培地で180細胞/μLに希釈します。
3. 希釈したサンプル120μLをスローインジェクションによりイメージングチャンバーにロードします。サンプルと一緒にイメージングチャンバー内の気泡の存在を徹底的にチェックします。気泡がある場合は、測定の品質を損なうため、慎重に取り除
いてください。
4. 市販の3D定量位相顕微鏡、またはホロトモグラフィーとそのイメージングソフトウェアを使用して、3D RIトモグラムを取得します.
   注:実験装置に関する詳細な情報は、元の原稿に記載されています。
   1. 顕微鏡の対物レンズの上に蒸留水を一滴垂らします。
   2. サンプルの入ったイメージングチャンバーを顕微鏡の並進ステージに置き、サンプルが対物レンズと揃うように位置を調整します。
   3. 対物レンズと集光レンズの軸位置を調整するには、イメージングソフトウェアの「Microscope」パースペクティブの「Calibration」タブで「Focus」と「Surface」をそれぞれクリックします。
   4. 対物レンズと集光レンズの位置を合わせるには、[Auto Mode] をクリックします。または、スキャンモードを使用して、照明パターンが視野の中央領域に位置するようにレンズを手動で調整します。
   5. ノーマルモードに戻り、移動ステージを調整して、視野内のセルを見つけます。
   6. 対物レンズの軸方向位置を調整して、焦点面を見つけます。完璧なフォーカスにより、画面上に視覚化されたサンプルの境界はほとんど見えなくなります。
   7. セルのない場所を見つけるために、変換ステージを調整します。
   8. [キャリブレーション] をクリックして、さまざまな照明角度で複数の 2D ホログラムを測定します。
   9. 移動ステージを調整して、視野の中央にセルを配置します。
   10. [取得] タブに移動し、[3D スナップショット] をクリックして、手順 2.4.8 で行ったのと同じ照明角度でセルのホログラムを測定します。
   11. 取得したデータが「データ管理」パネルに表示されたら、取得したデータを右クリックして[処理]をクリックすると、イメージングソフトウェアに実装されている回折断層撮影アルゴリズムを使用して、手順2.4.8および2.4.10で測定したホログラムから3D RIトモグラムを再構築します。
   12. 手順 2.4.5 から 2.4.11 を繰り返して 100 個を超えるセルを測定し、機械学習の統計的検出力を確保します。
   13. ステップ2.4.11.で処理されたすべての画像を視覚化できます。[データ管理] パネルで、データを右クリックし、[開く] をクリックしてデータを視覚化します。「Data Manager」パネルの「RI Tomogram」をクリックします。「プリセット」タブで、「ロード」をクリックし、「lymphocyte.xml」をダブルクリックします。これは、3D RI分布に従って断層像を視覚化するためにイメージングソフトウェアが提供する事前定義された伝達関数です。
5. 手順2.2〜2.4を繰り返して、すべてのリンパ球サブタイプの3D RI断層像を測定します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
フローサイトメトリー	BDバイオサイエンス	アリアIIまたはIII
イメージングチャンバー	株式会社トモキューブ	トモディッシュ
ホロトモグラフィー	株式会社トモキューブ	HT-1Hの
ホロトモグラフィーイメージングソフトウェア	株式会社トモキューブ	トモスタジオ
画像処理ソフトウェア	MathWorksの	Matlab R2017bの
ファルコンコニカル遠心チューブ	サーモフィッシャーサイエンティフィック	14-959-53A	15ミリリットル
リン酸緩衝生理食塩水	シグマ・アルドリッチ	806544から500ミリリットル
アンモニウム-塩化物-カリウム溶解バッファー	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A1049201
RPMI-1640 ミディアム	シグマ・アルドリッチ	R8758
ウシ胎児血清	サーモフィッシャーサイエンティフィック	10438018