磁性ガラス粒子による血液からの核酸抽出法

要約

出典: Rosenstierne, M. W., et al. Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole blood Samples. J. Vis. Exp. (2018年)。

このビデオは、磁性ガラス粒子(MGP)を使用して全ヒトの血液から核酸を抽出する技術を示しています。これは、シリカでコーティングされた小さな磁気ビーズです。溶解バッファーを使用して血液細胞を溶解すると、放出された核酸がシリカ被覆MGPの表面に結合し、サンプルから分子が抽出されます。

プロトコル

サンプル収集を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています

1. 患者からの採血

>注意:患者から全血を採取するときは、適切な実験室の安全対策を講じてください。手袋と眼鏡を着用してください。患者が隔離されている場合は、バイオセーフティレベル4の手順に従ってください。

1. 患者から全血を静脈内採取するには、小口径延長チューブ付きのバタフライニードルと、溶解/結合バッファーを含む採血真空チューブを使用します。患者の腕を下向きの位置に置き、収集チューブをバタフライニードルよりも低く配置します。蝶針を患者の静脈に挿入し、採血真空管を小口径エクステンションに取り付けます.
   手記：これにより、逆流を防ぐことができます。
2. 採血後、チューブの内容物を5〜10回ひっくり返して混合します.
   手記：1.6 mLの溶解/結合バッファーを含む採血管内の真空が残っているため、収集されたサンプルの量は自動的に1.6 mLになります。
3. 70%エタノールを使用してチューブの外側を消毒します。
4. チューブを室温で20分間インキュベートします
   手記：ここでプロトコールを一時停止し、全採血チューブを-20°C、5°C、25°C、または37°Cで少なくとも1か月間保存できます。
5. 簡略化されたNA抽出法に直接進みます。

2. 全血のNA抽出の簡素化

1. 溶解/結合バッファーで不活性化された採取血液からNAを精製するには、真空管を手で5〜10倍反転させてチューブの内容
物を混合します。
2. チューブの蓋を慎重に取り外し、蓋を排出します。
3. 調製したMGPのアリコート(1 mL)を直接採血管に注ぎます。
4. 未使用の採血管から新しい蓋を、サンプルの入ったチューブの上に置きます。
5. フタに指を当ててチューブがしっかりと閉じていることを確認し、採血管を手で5〜10回ひっくり返してチューブの内容物を混ぜます。
6. チューブをマグネットホルダーに入れ、蓋に指を置いて、チューブがしっかりと閉じていることを確認します。
7. マグネットホルダーとチューブを手で数回ひっくり返して、すべてのMGPがマグネットでチューブの側面に集まっていることを確認します
   手記：マグネットホルダーは、細長いマグネットと輪ゴムと交換できます。
8. チューブの蓋を取り外し、使い捨てピペットを使用するか、内容物を50mLのコレクションチューブに注ぐだけで、チューブの内容物を廃棄します><。 手記： 50 mLの収集チューブからのエアロゾルを避けるには、チューブを蓋で閉じます。.
9. 調製した洗浄バッファー-1(WB-1、4 mL)のアリコートを直接採血管に注ぎます。
10. チューブに蓋をし、蓋に指を置いて、チューブがしっかりと閉じていることを確認します。
11. チューブをマグネットホルダーから取り外し、蓋を指でしっかりと締めます.
    手記：磁石と輪ゴムを使用する場合は、輪ゴムと磁石をチューブから取り外すだけです。
12. 採血チューブを手で5〜10回ひっくり返して、MGPを再懸濁します。
13. 手順2.6〜2.8を繰り返します。
14. 調製したWB-2(1.5mL)の分注液を採血管に直接注ぎます。
15. チューブに蓋をし、マグネットホルダーからチューブを取り外します.
    手記：磁石と輪ゴムを使用する場合は、輪ゴムと磁石をチューブから取り外すだけです。
16. 蓋に指を置いて、チューブがしっかりと閉じていることを確認します。
17. 採血管を手で数秒間ひっくり返して、MGPを再懸濁します。
18. 手順2.6〜2.8を繰り返します。
19. 調製したWB-3(3mL)の分注液を直接採血管に注ぎます。
20. チューブに蓋をし、マグネットホルダーからチューブを取り外します.
    手記： 磁石と輪ゴムを使用する場合は、輪ゴムと磁石をチューブから取り外すだけです。
21. 蓋に指を置いて、チューブがしっかりと閉じていることを確認します。
22. 採血チューブを手で5〜10回ひっくり返して、MGPを再懸濁します。
23. 手順2.6〜2.8を繰り返します。
24. 調製した溶出バッファーのアリコート (EB, 100 μL) を採血チューブに直接注ぎます。
25. チューブに蓋をし、マグネットホルダーからチューブを取り外します.
    手記：磁石と輪ゴムを使用する場合は、輪ゴムと磁石をチューブから取り外すだけです。
26. 採血管を指で5〜10回軽くたたいて、EBにMGPを再懸濁します.
    手記：ここでプロトコールを一時停止し、チューブを-20°Cで保存することができます。
27. 1.5 mLの使い捨てピペットを使用して、再懸濁したMGPの1液滴(5 - 8 μL)を下流のNA増幅反応ミックスに移します(ループ媒介等温増幅(LAMP)/逆転写LAMP (RT-LAMP)または定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)/RT-qPCRアッセイなどの下流の診断NA増幅アッセイを使用できます)
    手記：NAはMGPにくっつくので、下流のNA増幅反応では必ずMGPを使用してください。使用前にMGP懸濁液を混合してください。混合後、MGPはチューブの底に集まります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Vacutainer K2 EDTAチューブ(4 mL)	ベクトン・ディキンソン	368861
プラス血液コレクション	ベクトン・ディキンソン	362725
23G×1針	ベクトン・ディキンソン	300800
LUER LOKシリンジ(3 mL)	ベクトン・ディキンソン	309658
小口径延長チューブ付きバタフライニードル	ヨルゲン・クルーゼ A/S	121714
1% バーコン	ノメコA/S	849265
MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I - Lysis/Binding Buffer - 詰め替え用	ロシュ・ダイアグノスティックスA/S	3246752001
MagNA Pure LC 全核酸単離キット	ロシュ・ダイアグノスティックスA/S	3038505001
Nunc™ Biobanking and Cell Culture 極低温チューブ (1,8 mL)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	375418
Nunc™ Biobanking and Cell Culture 極低温チューブ (3,6 mL)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	379189
Nunc™ Biobanking and Cell Culture 極低温チューブ (4,5 mL)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	379146
DynaMag-5™マグネット	サーモフィッシャーサイエンティフィック	12303D
トランスファーピペット(3.5mL)	ザルシュテット	86.1171.010
Thermo Scientific™ Samco™ Fine Tip Transfer ピペット(1.5 mL)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	231
Thermo Scientific™ Nunc™ 50 mL コニカル滅菌ポリプロピレン遠心チューブ	サーモフィッシャーサイエンティフィック	339652

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